PCR技术专题

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)是一种分子生物学技术,用于体外扩增特定的DNA片段。PCR技术主要过程是,通过人工合成的一小段单链DNA片段(引物)与模板DNA特定的区域特异性结合,以四种dNTP为底物,通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段,实现DNA体外扩增。

Polymerase-chain-reaction

PCR技术的发明使微量的核酸操作变得简单易行,同时使核酸研究脱离于活体生物,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。随着对PCR研究的不断深入,人们对常规PCR进行技术改进而衍生出了多种PCR技术,如荧光定量PCR、逆转录PCR、RACE-PCR、巢式PCR、反向PCR、降落PCR等。

常见的PCR技术

荧光定量PCR

荧光定量PCR是在反应体系中加荧光基团,利用荧光信号实时检测PCR进程并通过标准曲线对初始模板进行定量分析。

逆转录PCR

逆转录PCR是以RNA为模板,首先利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。

RACE-PCR

RACE即cDNA末端快速扩增技术,利用RACE可以通过已知的部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5′和3’端。

巢式PCR

巢式PCR是利用两套引物进行两轮PCR扩增。使用巢式PCR进行连续两轮扩增可以提高扩增的特异性和灵敏度。

反向PCR

反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段(常规PCR是对两引物之间的片段进行扩增)。

降落PCR

降落PCR是对PCR反应体系中退火温度进行优化,通过设置一系列不断降低的退火温度以提高PCR反应的特异性。

PCR实验

PCR实验准备

PCR实验操作

产物及分析
  • PCR反应产物纯化
  • PCR的相对定量测定
  • PCR的绝对定量测定

PCR技术应用

PCR技术在基因组学、分子生物学、临床医疗诊断及法医学等领域有着广泛的应用。下面为您介绍部分PCR应用领域:

  • 克隆:利用PCR克隆方法可将经过PCR扩增的双链DNA直接连接到载体上,与传统方法方法相比,不需要限制性内切酶的参与,操作更简便;
  • 测序:PCR可使微量的核酸得到富集,随后将核酸克隆至载体中进行测序;
  • 基因突变与检测:PCR技术能够通过克隆将所需突变引入目的基因中,继而进行突变研究;
  • 临床医疗诊断:PCR现已应用于细菌/病毒类疾病、遗传疾病及肿瘤等疾病的诊断;
  • 法医物证学:从案发现场的一根毛发、一滴血或者一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定;
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