噬菌体展示文库的构建与筛选

噬菌体展示技术是一种用于识别蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。下载由Simth于1985年建立。其原理是将外源多肽或蛋白质的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下,使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达,最终多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相对的空间结构和生物活性,可以利用靶蛋白对其进行筛选。

高亲和力抗体筛选

噬菌体抗体库构建

利用噬菌体展示技术进行高亲和力抗体的筛选,需要先构建抗体库,然后再对噬菌体文库进行筛选。将外源基因插入噬菌体基因适当位置,随着噬菌体的传代,外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。所有展示不同外源基因的噬菌体的集合,即噬菌体展示文库。

用于构建文库的不同序列的核酸片段有人工合成法、cDNA法、DNase I随机水解DNA等方法获得。用于构建文库的噬菌体展示系统有单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统及T7噬菌体展示系统等。
利用cDNA法获得基因片段并进行噬菌体展示文库构建的操作流程为提取mRNA ;逆转录得到cDNA ;设计合适引物,以cDNA为模板,PCR得到基因序列;将基因克隆至噬菌体载体中;电转感受态细胞,辅助噬菌体超染;收集上清,上清即为噬菌体展示文库。

噬菌体展示文库构建流程

图1:噬菌体展示文库构建流程

噬菌体抗体库的筛选

筛选的方法主要分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选是指将噬菌体展示文库静脉注射到动物体内,因为血管分子内皮的异质性,噬菌体可以有选择性的导向不同组织,这样就可以得到与不同组织特异结合的噬菌体展示抗体;体外筛选的方法有生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法。其中生物淘洗法最为常用。本文主要对生物淘洗法筛选噬菌体抗体库进行说明。

生物淘洗法:以靶蛋白为固定相,以噬菌体展示文库为流动相,经过一段时间的共同孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,即可得到与靶蛋白具有高亲和性的抗体。

噬菌体展示技术筛选流程

图2:噬菌体展示技术筛选流程

经过筛选后,对筛选得到的蛋白进一步用酶联免疫吸附测定或免疫印迹法对其进行特异性筛选,获取目的克隆或铺盘进行单克隆分离继而进行大规模生产。

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