噬菌体表面展示制备scFv

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单链抗体(scFv)是由抗体重、轻链的可变区基因通过一段编码约5-25个AA的连接肽基因(linker)拼接后表达形成的重组蛋白。scFv具有分子量小、组织穿透力强、体内循环半衰期短、免疫原性低、易于进行基因工程改进等优点,在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用。利用噬菌体展示技术,可以制备得到高亲和力、结构稳定的scFv抗体。本文对常用的scFv噬菌体展示系统及scFv噬菌体抗体库构建筛选做一介绍。

pCANTAB 5E噬菌体展示系统

人们利用噬菌体展示技术制备scFv噬菌体抗体库,经噬菌体抗体库筛选得到的噬菌体抗体通常具有较高的稳定性。pCANTAB 5E噬菌体展示系统是scfv噬菌体表面展示最常用的系统,该系统由噬菌粒载体(pCANTAB 5E)、宿主菌(大肠杆菌TG1、HB2151等)、辅助噬菌体M13K07等部分组成。

噬菌粒载体:pCANTAB 5E是scFv噬菌体表面展示最常用的噬菌粒载体,大小为4522bp,具体图谱及酶切位点如下所示:

pCantab5E噬菌粒载体图谱

图1:pCANTAB 5E噬菌粒载体图谱

宿主菌:pCANTAB 5E系统中宿主菌有大肠杆菌TG1及大肠杆菌HB2151两种,噬菌粒侵染两种宿主菌会得到两种不同的产物,侵染大肠杆菌TG1最终可得到scfv-plll融合蛋白,侵染大肠杆菌HB2151最终可得到可溶性的scFv蛋白。原因是在噬菌粒载体的目的基因插入位点末端有一段E-Tag短肽,短肽后有琥珀终止密码子,TG1菌株对琥珀终止密码子具有抑制性,蛋白翻译可通过琥珀终止密码继续翻译下游的Plll基因,最终产生scfv-plll融合蛋白,HB2151为非抑制株大肠杆菌,蛋白的合成在ScFv基因后即停止,最终会得到可溶性的scFv蛋白。

辅助噬菌体:M13K07辅助噬菌体是pCANTAB 5E噬菌体展示系统的重要组成部分。噬菌体转入宿主细胞后想要顺利传代必须要有辅助噬菌体的参与。

scFv噬菌体抗体库构建及筛选

1. 制备scFv基因库

收集目标抗体宿主的免疫细胞(B淋巴细胞、致敏B淋巴细胞、非致敏B淋巴细胞等),提取总RNA,经RT-PCR分别扩增出抗体的VH和VL编码基因,纯化回收VH和VL片段,使用Linker引物将全套VH和VL基因随机拼接成scFv基因库。

VH和VL的拼接方法目前有两种:

  • 将 Linker设计在表达载体上,两端各有限制性内切酶酶切位点供VH和VL插入;
  • 把 Linker的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中,用PCR直接合成ScFv基因:VH和VL通过 Linker互补序列,互为引物及模板合成完整的ScFv基因,再以两端的引物进行PCR扩增得到大量的ScFv基因产物。该方法被称为重叠延伸拼接法( splicing by overlap extension,SOE)

2. 将scFv基因转入噬菌体

将scFv基因转入噬菌体内,可以直接将scFv基因转到噬菌体基因上,也可以将scFv基因转入噬菌粒载体中。通常直接将scFv基因转入噬菌体体内的效率很低,比较常用的是第二种方式,将scFv基因连接至pCANTAB 5E载体上,构建噬菌粒。

3. 侵染宿主菌

噬菌粒构建完成后,便可进行宿主菌的侵染。宿主菌有大肠杆菌TG1及大肠杆菌HB2151两种,如果宿主为TG1,最终得到scfv-plll融合蛋白,并展示在噬菌体表面。如果宿主为HB2151,最终得到scFv蛋白,ScFv蛋白被排到细胞周质空间,因为缺少plll基因结构域而不能连接到噬菌粒颗粒上,经扩大培养可溶性抗体片段在周质空间积累并溢至培养液中。

噬菌粒转入宿主菌后,可在宿主菌体内自我复制,但由于缺少必要的功能基因,噬菌粒无法合成单链DNA、无法进行传代。为了使噬菌体顺利传代,在宿主菌生长至对数生长期后,需要进行辅助噬菌体超染。辅助噬菌体可以为噬菌粒提供必要的功能基因(pⅡ蛋白、包装蛋白等),促使质粒合成单链DNA并完成传代。(辅助噬菌体工作原理

4. 获得scFv抗体库

辅助噬菌体超染宿主菌后,噬菌体开始传代并裂解宿主菌,培养过夜离心收集上清即可获得噬菌体scFv抗体库;

5. 筛选噬菌体抗体库,得到高亲和力的scFv

以靶蛋白为固定相,以抗体库为流动相,经过一段时间的共同孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主菌后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,即可筛选出与靶蛋白具有高亲和性且结构稳定的scFv蛋白。

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