原核表达最常见的12个问题解析

摘要：根据各个原核表达研究者所提出的问题，我们就原核蛋白表达纯化进行了扼要的总结。

我不知道我的蛋白它有什么特性及其结构？

1. 首先，你要确定一件事，那就是这几个蛋白质有人研究过没有 ？还是最新发现的蛋白质？如果没有人研究过，那就得用先测部分氨基酸，然后设计引物克隆了。
2. 如果有人研究过，那就好了可以根据软件来预测。如有swiss—pdb软件，但这个是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在ncbi上进行blastx，得到蛋白。

如何选择蛋白表达宿主菌？

原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。一般选择菌主可看下表：

质粒测序正确，蛋白无法表达

1. 分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试rosetta（DE3）
2. 可能是基因本身的问题。RNA3’的特殊结构可能导致转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如pET-32a。
3. 也许是表达量太低，也可以试一下western blot，定性的检测一下。

如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？

T7 RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。

如何提高重组蛋白在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？

这个问题是最困扰做原核蛋白表达纯化的人的。比如大肠杆菌表达蛋白本身表达量就大，但是表达的大都是包涵体，想要获得可溶性蛋白，就需要做复性，或是再设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般就要通过基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等等。

1. 降低重组蛋白合成的速率
   可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
2. 密码子优化
   密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。。
3. 表达温度的选择
   大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。
4. 诱导条件优化
   摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。

目的蛋白总是以不可溶的形式出现

在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。然而，让目的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。不溶态在某些情况下非常有利：

1. 形成包涵体是目的蛋白表达量很高的表现。
2. 作为初步分离，将目的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75–95%的目的蛋白。
3. 存在于包涵体中的目的蛋白通常可以免于蛋白酶的水解破坏作用。

研究者采用下述方法加强蛋白重折叠的效果，并在很多蛋白上取得了好结果，可以尝试以下：当蛋白还结合在树脂上时，使用6M–8M梯度盐酸胍、1mM还原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽处理，继而用咪唑正常洗脱。有些实验室在透析去除变性剂的过程中加入底物或类似物，也有帮助酶折叠的效果。

我要的是全长蛋白，怎么还有截短的产物，这是怎么回事？

1. 一个最直接原因就是蛋白水解了。
2. 然而第二点翻译起始也非常有可能。起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列(AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有His-Tag。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列载体在N-端融合有HiS-Tag序列而C-有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His- Bind树脂亲和纯化以获取全长蛋白。

His标签包在蛋白质结构内部还能用蛋白酶切除吗？

一般重组蛋白纯化标签被包在内部，可以增加所提的蛋白质样品的溶解度，比如适量增加变性试剂浓度或类型使得蛋白质的肽链松散开暴露出（组氨酸）6标签。另外，还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型，加大DTT浓度（DTT浓度<1mmol/L，否则DTT会与Ni²⁺结合），适当调整调高盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L，从低浓度到高浓度逐渐分梯度上升），总之，作用就是增加蛋白质的可溶性，因为his6的亲水性较强，增加可溶性之后his6容易暴露在水相。加大DTT浓度也可以切断二硫键使得蛋白质的肽链松散，进而使his6容易暴露在水相，从而方便纯化和酶切。再者重新构建，不加His-tag。

目的蛋白大于100kd或含有多个亚基，是否可以用原核表达系统？

在细菌中已经非常成功底表达了很多大蛋白。多亚基复合物则可以通过分别表达各亚基，然后在有尿素的溶液中，将各组分以适当比例混和，再透析除去变性剂。

是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？

位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。

如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？

蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。

E. coli会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？

N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第二位氨基酸的支链大小的增加而降低。研究者在实验中发现以下氨基酸种类出现在倒数第二的位置上时，此加工过程极少发生或根本没有发生：His、Gln、 Glu、Phe、Met、Lys、Tyr、Trp和Arg。而当倒数第二位上是其它种类的氨基酸时，加工过程发生的可能从16%到97%，确定了在大肠杆菌中蛋白氨基末端氨基酸与其稳定性之间的关系，也即“N-端原则”。具他们报导：如果下列氨基酸位于氨基端时蛋白的半衰期仅为2分钟：Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端时可以使受检蛋白的半衰期长达10小时以上。综上两条研究可以得出结论：Leu在氨基末端时很容易因为fMet被去除而暴露出来，从而导致蛋白的迅速水解。显然，当采用pET载体上的 Nco I 或 Nde I位点表达非融合蛋白时，完全不必担心Leu的密码子出现在倒数第二的位置上。

更多原核蛋白表达问题可以访问资料专区

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细胞的稳定转染

稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。

稳定转染实验流程

从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。

细胞复苏

细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。（查看细胞复苏及细胞传代培养实验操作）

载体构建及细胞转染

将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。

细胞池筛选

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转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。

稳定转染实验影响因素

• 外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；
• 拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；
• 结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；
• 整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；

稳定转染的应用

应用场景

瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、蛋白质的小规模合成。相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。

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离子柱常见问题分析及解决方案

摘要：本文主要针对离子柱纯化蛋白中常见的问题进行分析，解释其原因并提出相应的解决方案。

缓冲液如何选择

用Tris-HCl还是PB，选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好，浓度一般50mM，但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

洗脱采用的离子强度的大小范围应该如何确定

离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大，洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大，0.01mol/l到1mol/l，甚至3.0mol/l，PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。

蛋白挂在阳离子交换柱上洗脱不下来

1. 蛋白与离子柱得结合太强，换弱阳的琼脂糖凝胶介质，比如由sp的换成CM。
2. 减少离子柱与样品的结合时间，防止蛋白沉在柱上。
3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用0.1M氢氧化钠洗。

标签蛋白易洗脱

1. 离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白，最大可能性是上样量过大，流速太大，建议增加清洗的体积数，减少上样量，降低上样速度。
2. 上样完洗脱前，清洗的不彻底。
3. 标签没有表达出来：
   • 可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合。
   • 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。
4. 填料有问题，换填料。
5. PH、离子强度是否合适，平衡缓冲液是否应与样品缓冲液pH、离子强度相同。

标签包涵体蛋白易洗脱

1. 蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签，而使得蛋白质无法挂柱。
   • 因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻碍了标签与离子柱形成共价键。
   • 环境影响：pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等。增加所提的蛋白质样品的溶解度或还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型。
2. 柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液PH不适合，缓冲液pH要与蛋白质pI差1-2。
3. 有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合，通过降低洗脱液pH值使得标签质子化而使得污染蛋白质从层析住上被洗脱。
4. 一些蛋白质或DNA与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用，可以用低浓度的去污剂（2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）或增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）。
5. 填料有问题，换填料。
6. 最后可以考虑一下试剂的问题。

目的蛋白先洗脱杂蛋白被吸附

1. 更换缓冲液，可能pH与蛋白质pI较接近。
2. 填料选择不对，与蛋白结合力太弱，更换适合改纯化蛋白质的填料。
3. 直接收取目的蛋白，再用其他纯化方法进一步纯化。

蛋白纯化出现沉淀

1. pH发生变化，导致蛋白质沉淀。
2. 离子溶度过高，缓冲液的离子溶度降低。

注意事项

1. 倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。
2. 装柱的注意事项:
   • 装柱时应注意液面不能低于树脂表面。
   • 树脂悬浮液的温度要相对恒定或与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响分离效果。
   • 装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱。
   • 在装柱的同时应该将其他仪器设备（如：恒流泵等）电源接通，并按实验要求进行预热和调试。需将恒流泵流速调至0.4ml/min。
3. 应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样，且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 （第一管，应在4ml处做一标记）。
4. 加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面，以及在柱内形成气泡，影响分离效果。
5. 20%乙醇保存柱子。

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细胞生长曲线绘制-MTT法

摘要：通过MTT法可以得到细胞的生长曲线，也可对瞬时转染后的细胞进行检测，本文主要介绍了MTT的作用原理及实验操作要点。

MTT全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT主要有两个作用：① 药物（或其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定（如细胞瞬时转染表达后可对细胞进行MTT检测）② 用于细胞增殖及细胞活性的测定，可以制得细胞生长曲线。

MTT法检测细胞存活和生长的主要机理是：活细胞中的某些物质（线粒体中的琥珀酸脱氢酶）能够和MTT反应，使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（图1）并沉积在细胞中，而死细胞没有此功能。DMSO（二甲基亚砜）能够将此结晶（蓝紫色甲瓒）溶解，在酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值，能够间接的反应活细胞的数量。一定范围内，蓝紫色结晶沉淀的数量与细胞数成正比。目前MTT法因其灵敏度高，经济快速等优势被广泛的运用于细胞毒性试验，肿瘤药物的筛选、放射敏感性测定和对某些生物活性因子的活性检测等方面。MTT法也有自身的缺点，如MTT检测生产的蓝紫色产物（甲瓒）不溶于水，需被溶解后才能检测。一方面使得工作量增加，另一方面对实验结果的准确性产生一定的影响，且用于溶解甲瓒的有机溶剂对人体有一定的危害。细胞瞬时转染表达后的细胞也可做MTT实验，多数人不知道是先转染再做 MTT，还是先做MTT再进行瞬时转染，这里建议是先做转染，培养一段时间后（24/48h），重新接种至96孔板，加药两天左右，再进行MTT检测。

水不溶性的蓝紫色甲瓒

实验准备

1. 仪器：酶联免疫检测仪，血球计数板，96孔板，离心管等
2. 试剂：MTT溶液，胰蛋白酶，DMSO（二甲基亚砜），血清培养基
3. MTT 溶液的配制
   用PBS缓冲液溶解MTT粉末。PBS（ ph=7.4）配置：Nacl （8g）+ Kcl（ 0.2g）+Na₂HPO₄ （1.44g）+KH₂PO₄ （0.24g）调pH 7.4,定容至1L。
   此处MTT 的浓度为：5mg/ml。称取 0.5克MTT粉末，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤除去溶液里的细菌。在配制和保存的过程中，最好避光。如在超净台中配置该溶液，可将日关灯关掉操作，同时容器用铝箔纸包住(避光)，4℃ 避光保存即可。使用勿超过两周，一旦MTT变色，即刻停止使用。建议是MTT最好现用现配，分装一定量的MTT粉末在EP管中，用的时候现配直接加到细胞培养板中操作方便也避免浪费。
   此外，MTT具有致癌性，无论是配置还是实验都要注意做好防护准备。MTT对菌敏感，配置或保存的时候要保证无菌，且要避光。

在进行实验时，由于实验作用时间较短，因此可不避光，但是要将超净台的日光灯关掉，效果会更好。

实验操作

1. 常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，用血清培养基悬浮细胞，制成单细胞悬液，并用进行细胞计数
2. 接种细胞：稀释细胞浓度至1×10⁴ /ml。吸取200ul的细胞悬液加入到96孔板中（注意设置空白对照组）
3. 对于瞬时转染的细胞，转染后24h消化细胞，重新接种至96孔板，培养18h加药两天后进行MTT检测
4. 细胞培养：常规培养细胞，每两天换一次液
5. 呈色：从细胞培养第二天开始，即可每天按照固定时间取出96孔板并加入MTT溶液20ul，37℃培养4h后，将孔中上清小心的吸去，加入150ul的DMSO，震荡10min，使沉淀充分溶解
6. 在酶联免疫检测仪上设置490nm波长测定吸光值，进行检测并记录结果（取平均值）
7. 每天取出96孔板重复操作，并记录结果
8. 以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线

结果分析

绘制结果应当如图2所示，呈现S形。与细胞培养计数法获得的生长曲线接近。前三天左右为停滞期，随后细胞进入对数生长期，最后进入稳定生长时期。

因为在相同体积内细胞数与吸光度成正比，所以在对数生长时期，曲线越倾斜（斜率越大），细胞的群体倍增时间越短。

图2 MTT法实验结果

操作要点

• 实验设置空白对照组，步骤保持一致，一组只加培养基不加细胞，比色以空白调零
• MTT实验吸光度最后在0-0.7之间，超出这个范围则不是直线关系
• 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲瓒颗粒进行比色测定
• 实验中使用各培养基的量，按照说明书操作（根据经验适时调整）
• 每孔细胞浓度维持在20个/ul，加20ul MTT，作用四小时后洗掉上清液。注意不要将甲瓒洗掉，然后每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，然后测吸光值
• 细胞瞬转MTT检测，转染6h，24h或48h消化细胞进行重新接种，此时间根据细胞生长状态决定，一般在加药2天后进行MTT检测

利用细胞计数法也可以绘制生长曲线，具体的实验操作及结果分析方法请查看：细胞计数法绘制生长曲线

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细胞生长曲线绘制-细胞计数法

摘要：细胞生长曲线的绘制方法多种，本文主要介绍通过细胞计数法绘制生长曲线，帮助我们更好的了解细胞的生长状态及活力，从而指导下游实验操作。

细胞计数法绘制生长曲线，是细胞培养研究中常用的技术手段。原理就是通过测定单位体积内的细胞数量，得到细胞的总浓度进而计算出细胞总数。

典型的细胞生长曲线分为四个时期：延滞期，指数期，稳定期和衰亡期。不同时期的细胞生长状态和性能各不相同。通过测定生长曲线，可以测定细胞绝对生长数，判断细胞活力，可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响，有助于我们选择该时期的细胞进行细胞下游实验（瞬时转染或稳定转染）。以下介绍细胞计数的主要方法和注意点：

实验准备

1. 仪器：二氧化碳培养箱，显微镜，超净工作台，血球计数板
2. 试剂：胰蛋白酶，培养基（血清）

实验操作

1. 取生长良好的细胞，用胰蛋白酶消化，离心
2. 离心后去上清，加入新鲜适量的培养基重悬细胞，使之成为单细胞悬液
3. 按照一定的倍数稀释该单细胞悬液，稀释倍数以稀释结果细胞数在20-200之间为合适倍数
4. 准备血球计数板，洗净晾干
5. 吸取一定量的细胞悬液，加样到血球计数板上，显微镜下计数
6. 按照血球计数板的计数原理进行细胞计数
7. 计算细胞总数， 调整细胞至一定浓度（1×10⁵/ml）。细胞浓度=细胞计数板得到的细胞数量/4x稀释倍数x10⁴/ml
8. 细胞再培养，准备24孔板，每孔中加入0.1ml的细胞（即1×10⁴个细胞）和0.9ml的细胞培养基，轻轻晃动孔板（十字方向晃动），使细胞分布均匀，并进行常规细胞培养（48h后换液培养）
9. 培养48h后，即可每过24h取样一次，每次取样至少取3个孔的细胞，多次计数取平均值，提高准确性），取样细胞常规胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，显微镜下进行细胞计数
10. 计数结果，以时间（d）为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线

结果分析

根据培养的时间和细胞计数的结果得到如下图，细胞培养初始几天生长缓慢，为延滞期。两到三天之后细胞进入对数生长期，此时细胞生长最为旺盛，细胞活力也相对最佳，通常在我们的细胞转染或构建稳定细胞系时选择对数生长期的细胞。一段时间后细胞进入稳定生长时期

操作要点

• 细胞用胰蛋白酶消化，消化时间要自己把握，时间短细胞消化不好形成团状，时间长细胞死亡率可能会增加，制备成单细胞悬液即可
• 细胞计数时，按照计数原理数细胞，每个大方格中的细胞大于200小于20，则稀释倍数不适，需重新稀释。在消化细胞计数之前，可自己估算培养瓶中的总细胞数，这样可以预估下稀释的倍数，避免重新稀释
• 细胞接种时细胞摇均匀，接种按照十字方向晃动，晃动时间可以延长，以避免形成细胞团为准，但要防止细胞液溅出
• 细胞培养易被污染，污染原因也多种多样，实验室环境，细胞自身原因，如果为菌类污染建议丢弃重新复苏培养，更多相关情况及解决可参考资料专区细胞培养FAQ

细胞计数法绘制生长曲线，操作相对简便。此外，MTT比色实验也能检测细胞的存活和生长，得到细胞生长曲线，且灵敏度高，重复性好，具体原理和操作见MTT法绘制生长曲线。

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哺乳动物细胞重组抗体表达

摘要：抗体的生产可通过不同的方式，哺乳动物细胞生产或刺激动物免疫系统生产，本文主要了介绍两者的生产方式和区别。

单抗和多抗定义

蛋白结构表面可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇（又称抗原表位见右图）。它一般由6-12个氨基酸或碳水基团组成，可以是由连续序列组成或不连续的蛋白质三级结构组成。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体可以产生多种不同的抗体。由单一B淋巴细胞产生仅识别一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。由多种B细胞产生，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体称为多克隆抗体。单抗与多抗的区别可参考单抗与多抗的区别。重组抗体生产根据基因序列制备得到单抗，通过构建稳定表达细胞系满足对抗体量的生产。

重组抗体和免疫抗体制备

抗体的生产有两种方式。①利用重组蛋白的方式获取接近天然条件下的重组蛋白（或多肽），通过刺激动物免疫系统，最终获得抗体。②利用哺乳动物细胞生产，在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体上，进行重组抗体的表达。刺激动物免疫系统可以生产单抗或多抗，这种方法成功率高且抗体效价较好。而通过序列进行重组抗体表达，针对特定基因只能生产单抗。两种生产方式在作用原理和流程等方面都有一定的区别和联系，具体如下：

1.生产流程

哺乳动物细胞重组抗体生产

刺激动物免疫系统制备单抗

两种方式制备单抗综述

1. 抗原的制备：通过刺激动物免疫系统生产单抗前提是要获得抗原，抗原可以是可溶性蛋白，多肽。可溶性蛋白通过重组蛋白生产得到。多肽作为抗原与载体偶联免疫小鼠，用多肽进行筛选，如不能进行抗体筛选，需偶联另一种载体进行筛选；
2. 免疫动物：免疫动物一般选用6周龄的小鼠，根据自己制定的实验方案操作。用已经制备的抗原免疫小鼠，使其分泌B淋巴细胞，进行下一步的融合；
3. 细胞融合：实验前准备好骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞与B淋巴细胞按照一定的比例融合，形成杂交瘤细胞；
4. 杂交瘤细胞选择培养筛选：用HAT筛选①培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞；
5. 融合细胞的单克隆生长鉴定：采用有限稀释法或其他方法进行杂交瘤细胞的克隆培养，通过鉴定最终得到能够生产单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。

哺乳动物重组抗体在以上流程的基础上进行

1. 构建稳定表达细胞系：对上述实验得到的抗体测序得到抗体的序列，利用哺乳动物细胞生产重组抗体的方式表达，筛选可稳定表达的细胞系。
2. 单克隆抗体的大量制备：筛选出能够稳定生产的细胞系，满足后续对抗体的大量需求，节约后续实验时间。

2.制备单抗的原理

哺乳动物细胞重组抗体表达

传统的生产抗体的方式是用抗原刺激动物免疫系统，这种方式需先制备抗原，且利用这种方法生产抗体难以满足大量的生产（需求大量的实验耗材和时间）。而哺乳动物细胞生产抗体的方式有一定的优势。①已知抗体的基因序列，将序列克隆到表达载体上，导入到哺乳动物细胞体内培养，通过一系列的筛选简单最终获得能够稳定生产此抗体基因的稳定细胞系，这一过程需要大量的时间，才能筛选出足够稳定表达的细胞系，并能够在后续实验中稳定长期生产。②未知序列的抗体大量生产，先刺激动物免疫系统得到少量抗体通过测序得到抗体序列，通过哺乳动物细胞重组抗体表达筛选稳定表达的细胞系，满足大量生产需求。

刺激动物免疫系统制备抗体

制备抗原，用抗原刺激动物免疫系统，将抗原处理过的B细胞和骨髓瘤细胞融合，融合后的细胞既具有B细胞合成专一抗体的特性同时又能够无限增殖（B淋巴细胞不能再体外生长，应用杂交瘤技术可使其在体外无限增殖）。经过HAT筛选，体外培养融合成功的细胞或在体内腹水培养，单克隆生长，最终进行抗体检测。刺激动物免疫系统生产抗体需要制备抗原，抗原可通过重组蛋白生产的方式获得，通过先获得抗原再生产抗体。

HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

细胞融合是一个随机的过程，融合后可能会出现的细胞有杂交瘤细胞，融合的脾细胞与脾细胞，融合的瘤细胞与瘤细胞，未融合的脾细胞，未融合的瘤细胞以及细胞多聚体。那么，如何才能筛选出杂交瘤细胞？对于正常的脾细胞，它在培养基中的存活期为7-14天，因此无需特别筛选，细胞的多聚体也容易死去，只有未融合的瘤细胞需要特别筛选除去。

选择培养基有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H），氨基喋呤（aminopterin，A），胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T），故称为HAT培养基。

细胞DNA合成有两个途径：

A.主要途径：由糖，磷酸，氨基酸，CO2，NH3等化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。而氨基喋呤是是叶酸的拮抗物，可以阻断杂交瘤和瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。

B.应急途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷共同存在的情况下，经过次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）共同催化合成DNA。而瘤细胞是该两种酶的缺陷型，因此不能再HAT培养基上生长，不合成或不分泌免疫球蛋白，只有融合的杂交瘤细胞具有脾细胞和瘤细胞的遗传性能，可以通过应急途径合成DNA，在HAT培养基上长期存活，繁殖和分泌抗体。

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离子交换色谱的原理介绍和实际操作

摘要：本文主要从基础原理与实验设计思路两个方面讲述了蛋白纯化实验中离子交换色谱的应用，并附有AKTA离子交换色谱操作案例。

基本原理

离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。

离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架构成，骨架上有许多共价结合的带电基团，如果侧链是带正电基团，就可与带负离子相结合，称为阴离子交换剂，吸附带负电蛋白质。如果侧链是带负电的基团，则称为阳离子交换剂。强离子交换树脂在宽pH范围内保持离子化，而弱离子交换树脂只在窄pH值内离子化。

绝大多数重组蛋白纯化都要用到离子交换。离子交换色谱的基础是高分辨率，可以直接放大规模应用在工业上，柱再生容易，还可以使蛋白浓缩。大多数蛋白质的静电荷是负值，因此阴离子交换色谱的应用最为广泛。

实验设计

介质的选择

离子交换介质首先要考虑目的分子的大小，因为目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团，因此也会影响介质对目的分子的动力载量，从而影响其分离。

对于大多数纯化步骤来说，建议从开始的阶段使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。而未知等电点的蛋白质，在实际操作中常采用这样的方法，先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阴离子交换柱。根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液pH。

流动相的选择

离子交换色谱的流动相必需是有一定离子强度的并对pH有一定缓冲能力的溶液。为了避免目的蛋白失活，使用缓冲液可稳定流动相的pH，使之在色谱过程中不发生明显变化，同时可稳定目的分子上的电荷量，保证色谱结果的重要性。

选择缓冲液一般按照以下原则：阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，可用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等；起始缓冲液的浓度应尽可能低（<100mmol/L）这样可以使色谱柱上更多的吸附分离物质；缓冲液应不含会影响被分离物质活性和溶解度成分，洗脱时尽量不采用pH梯度洗脱。

色谱柱的选择

离子交换色谱通常选用粗短柱，即高径比小的色谱柱。典型的离子交换柱高度在5~20cm，高径比一般小于5。如果需要增加离子交换剂的体积，只能从增加柱的直径而不能增加其高度。如果是连续梯度洗脱，可以适当增加柱的长度。

案例介绍（AKTA Pilot）系统

离子交换是蛋白纯化中的重要手段，即可以用于捕获阶段，也可以用于精纯阶段。

预处理和装柱

1. 将超纯水与沉降胶按1:3比例悬浮，轻轻搅匀；
2. 将色谱柱固定到设备支架上，链接出口管道，从柱底端进口反向泵入超纯水，排除管道及筛板中的气泡，停泵，然后从出口端放出部分超纯水，保留1~2cm高度超纯水，封死出口端，然后正向冲洗进口端管道和适配器，排除筛板和管道中气泡；
3. 通过玻璃棒引流将悬浮胶导入色谱柱，在柱上端补充部分超纯水，搅匀，装上适配器；
4. 将柱出口端与色谱设备连接，以0.2MPa恒压装柱，装填至恒定的柱床高度，标记柱床胶面位置，关闭泵，松开适配器，降低适配器至胶面下2mm处，继续装填，待柱床高度稳定后，标记柱床胶面位置，降低适配器至柱上标记柱床位置下2mm。固定适配器，继续装填2~3柱体积；
5. 确定柱体积，测量柱高，计算柱体积及记录装柱时的最大流速；
6. 选择最佳线速，用0.5mol/L NaOH冲洗柱，冲洗3~5体积；
7. 接着用超纯水冲柱，冲洗10柱体积，至pH显示接近超纯水pH。

柱的平衡

20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.5，用10柱体积平衡缓冲液平衡柱子，直至pH及电导率监控显示与平衡缓冲液的pH及电导一致。

加样

根据柱体积及装柱的最大流速确定上样流速，上样流速不超过装柱最大流速的75%，同时，上样流速也要尽可能低，保证样品和介质充分发生作用。

洗脱

上样结束后，用平衡缓冲液冲洗1~2柱体积，使UV280响应信号重新回到基线。

之后用含有0.5mol/L NaCL的溶液洗脱，冲洗2~3柱体积，收集色谱峰。

常见问题分析

1. 纯化后样品纯度不高怎么办？
   • 若目标蛋白和杂蛋白等电点差异较大，目标蛋白通过穿透步骤获得，通过调节起始缓冲液pH，使目标蛋白与填料之间的静电作用更强；
   • 若目标蛋白和杂蛋白等电点差异较小，目标蛋白通过洗脱步骤获得，过调节起始缓冲液pH，使目标蛋白与填料之间的静电作用更强；再调节洗脱溶液的离子强度和pH，使目标蛋白与杂蛋白逐渐分离；
   • 选择合适的离子交换填料及粒径；
   • 柱没有经过起始缓冲液的充分平衡；
   • 降低洗脱流速；
   • 调整样品溶液黏度。
2. 纯化后的蛋白收率较低怎么办？
   • 调整样品pH，使样品pH与起始缓冲液pH保持一致；
   • 改变洗脱模式，如将线性梯度模式改变为阶段性梯度洗脱；
   • 改变洗脱方法，如将pH洗脱方法改为盐梯度洗脱方法；
   • 改变洗脱强度。
3. 样品过于粘稠怎么处理？
   • 样品过于粘稠可能是由于含有的蛋白太多，或者含有大分子量的核酸分子，通常有以下解决方法：
   • 增加裂解前稀释细胞所用体积；
   • 增加裂解时间，直至黏度下降，或者增加DNase和Mg²⁺的剂量；
   • 增加机械裂解细胞的效率；
   • 降低上样流速。

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哺乳动物细胞传代培养

随着细胞基因工程的不断发展，目前有多种生物表达系统都能够大规模的生产重组蛋白，主要分为原核和真核两类。真核表达系统又包括：酵母表达系统，哺乳动物细胞表达系统，昆虫杆状病毒表达系统。相比之下，哺乳动物细胞表达系统最突出的优点是能够促进蛋白的正确折叠和糖基化等翻译后修饰，从而保证蛋白的天然活性，目前已成为表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。

哺乳动物蛋白表达常用的细胞有HEK293（人胚肾细胞）和CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。这两种细胞的应用最为广泛，是在真核蛋白表达系统中最常用的细胞，具有以下特点：

1. 具有准确的转录后修饰功能，表达蛋白在任何方面都最接近天然状态；
2. 具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白整合稳定；
3. 具有较高的耐受剪切力和渗透压能力，表达水平较高；
4. CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌细胞，自身很少分泌内源蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化；
5. HEK293细胞具有更高的生长密度更快的生长速度，易培养，易转染。

本文主要对HEK293细胞及CHO细胞传代培养的基本原则、实验步骤及注意事项进行介绍。

细胞培养基本原则

合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是细胞传代培养最重要的条件，培养基不仅提供给细胞在体外生长繁殖需要的基础物质，还维持细胞生长的整个环境，不同的细胞有不同的生长习性，因此要选择合适的培养基。

优质血清

目前，多数的合成细胞培养基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、马血清等。血清中含有细胞生长所必须的生长因子，作为哺乳动物细胞培养的附加物，血清十分昂贵且存在多种问题，因此人们在不断寻找可以替代血清的物质。

无毒无菌的生长环境

体外生长的细胞缺乏对微生物和有毒物质的抵御能力，一旦被污染，会导致细胞死亡。因此在进行细胞传代培养时，无毒无菌的培养环境是必要条件。

温度与气体环境

细胞生长需要恒定的温度，同时气体（氧气与二氧化碳）也是哺乳动物细胞培养的所必须的物质，HEK293和CHO的细胞培养条件一般是37℃，5%的二氧化碳环境。

细胞传代实验流程

细胞复苏

1. 提前将水浴锅打开，预热37℃。
2. 细胞培养基提前预热，5-10ml于15ml离心管中。
3. 把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，待融化后（大概1-1.5min），取出。
4. 用75%乙醇消毒管外壁，放入超净台,转移到含5-10ml培养基的15ml离心管中，离心800-1000rpm，5min。
5. 去掉上清，加入完全培养基重悬细胞，转移到培养皿中，前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞分散均匀。
6. 标记好细胞名称，代数，日期，培养基等，放到37℃的5% CO2培养箱中培养。
7. 贴壁细胞培养一般第二天就可以贴壁，根据细胞生长速度，2-3天换一次培养基。
8. 离心可能对某些细胞造成伤害，这些细胞可以不离心，只需要将DMSO的浓度降到1%以下即可。（一般冻存液中DMSO浓度为10%，即1ml冻存细胞需加9ml培养基。）

细胞传代培养

1. 当培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时需要进行细胞传代。
2. 吸掉培养皿中的旧培养液。
3. 用5ml PBS洗涤细胞1-2次。
4. 用1ml的trypsin（胰酶）溶液，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞呈圆形即将分离时，吸掉trypsin溶液。（若不去掉trypsin溶液，则在消化后加入适量（5:1）含血清培养基终止作用，离心后再去掉上清。）
5. 轻拍培养皿或培养瓶使细胞从瓶壁脱落，加入适量的新鲜完全培养基，轻柔地吹打数次，使细胞分散均匀。再根据稀释比例转移至新的培养瓶中，正常培养即可，剩余细胞悬液舍弃，放入收集瓶中。（细胞传代时按1：5或更大比例稀释）
6. trypsin溶液中可以加入0.02% EDTA溶液，解离效果会更好，但消化后残留在培养基中的EDTA 会影响细胞的再次贴壁。

细胞冻存

1. 冷冻前确保细胞处于指数生长期，传代后的5mL细胞悬液取出1mL接种到培养瓶继续传代。另取一无菌离心管，将剩余4mL细胞悬液置于其中，离心1000rpm，5min（转速勿超过1500rpm）。
2. 离心后倒掉上层清液，收集下层细胞沉淀。向离心管中加入900ul完全培养基，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率。一般细胞浓度为2~5×106cells/mL较适宜。
3. 将细胞悬液转入1.5mL无菌冻存管中，再加入100ul试剂级DMSO，混匀，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为10％）。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期，然后进行冻存。
4. 传统方法：冷存管置于4℃ 10分钟→-20℃ 30分钟→-80℃ 16~18小时（隔夜）→液氮罐长期储存（-20℃勿超过1小时，防止胞内冰晶过大造成细胞死亡）。

细胞培养注意事项

• 细胞培养大瓶好于小瓶，细胞能够充分汲取到养分且有利于细胞均匀分布
• 细胞培养基DEME为高糖培养基
• 保证细胞培养液新鲜，采用少量多次配置，或培养基保存于-20℃
• 控制胰蛋白酶消化时间，消化时间长，细胞贴壁效果差
• 控制好细胞传代时间，细胞没有完全铺满、细胞之间留有空隙时传代最佳
• 细胞冻存和复苏的原则是慢冻快复，最大程度的保证细胞复苏成功率

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