兔单克隆抗体kappa链的独特结构——域间二硫键

免疫球蛋白分子的结构和稳定性取决于于免疫宿主动物的类别和亚类。与啮齿动物相比，兔子对小分子、精细表位也可产生有效的免疫反应，抗体产量高，获得高亲和力抗体的机率更大。兔抗体分子的稳定与轻链的多样化是密不可分的。兔子只有一个γ免疫球蛋白（IgG）同型，其重链可变区的VH1种系使用率约为80-90%。但兔子轻链是多样化的，除了λ链，还有b4、b5、b6和b9四个κ异型。兔子κ链Cys80和Cys170之间存在一个二硫键，将κ链的可变区（Vκ）与恒定区（Cκ）连接在一起（图1a），这个域间二硫键是兔抗结构特有的。

有研究人员使用三个κ-b4轻链同种异型的单克隆IgG（A3、A4、G11），通过定点突变，用Ala取代Cys80和Cys170产生IgG-AA。通过差示扫描量热法（DSC）和等温滴定量热法（ITC）测定了IgG-AA与IgG的热稳定性和结合活性参数，分析了这种Vκ-Cκ域间二硫键在IgG稳定性和抗原相互作用中的作用。

图1 兔κ链可变区和恒定区之间的二硫键

注：（a）兔子Fab结构，重链（H）和kappa链（κ）的可变区（V）和恒定区（C）分别标记为VH（绿色）、CH1（灰色）、Vκ（浅绿色）和Cκ（洋红色）。二硫键以黄色显示。Vκ和Cκ结构区之间独特的二硫键显示在右框中。（b）三个IgG κ链二硫键所在位置的氨基序列。两个保守的半胱氨酸用黄色标出。（c）IgG和IgG-AA示意图。

二硫键对兔单克隆抗体热稳定性的影响

兔子单克隆抗体κ链中的二硫键有助于提高抗体的热稳定性，二硫键的存在不影响抗体结构域的折叠及结构域间的接触，仅从动力学和熵变两方面影响IgG的热稳定性。实验结果显示，二硫键对整体结构没有显著影响，所有三种抗体（IgG和IgG-AA）尺寸排阻层析（SEC）检测的洗脱曲线几乎相同。三种同种异型抗体（包括IgG和IgG-AA）熔解曲线计算的表观量热展开焓（ΔHm）几乎相同。热变性重新扫描显示，IgG-AA第一次变性时熔解温度（Tm）的降低幅度大于其他峰。G11组扫描结果显示，扫描速率越小，变性开始越早，Tm也越低，且IgG-AA组的变化更大。表明兔抗体二硫键的热稳定不是热焓变化的结果，这种热稳定性主要取决于动力学稳定性，抗体热变性时域间二硫键会成为能量屏障，干扰热变性的初始步骤。

图2 A4、G11和A3的IgG和IgG-AA DSC热分析图

注：IgG和IgG-AA的结果分别用虚线和实线表示；（a）A4 IgG浓度为17.9 μM，A4 IgG-AA为14.8 μM；（b）G11 IgG为24.5 μM、G11 IgG-AA为25.3 μM；（c）A3 IgG为16.7 μM、A3 IgG-AA为14.1 μM。

表1 熔解中间温度（Tm）和变性焓（ΔHm）

注：通过扫描1.0°C/min的DSC测量所得。

二硫键对兔单克隆抗体抗原结合活性的影响

通过ITC分析兔IgG和IgG-AA与抗原的结合活性，获得的热力学参数示如表2所示。3种同种异型IgG和IgG-AA与抗原的解离常数差异非常微小，相互作用的焓变（ΔH）或熵变差异也非常小，表明二硫键对抗体结构无显著影响，对抗体-抗原相互作用的非共价键形成（ΔH^°）、水合作用和灵活性的变化（−TΔS^°）影响也非常小（图3和表2）。

图3 A4 IgG（左）和IgG-AA（右）与ITC分析的抗原相互作用

表2 热力学参数

注：通过ITC测量热力学参数，25°C时的参数显示为三次测量的平均值±s.d.。

兔抗体中连接V_κ和C_κ的二硫键不影响抗原抗体相互作用，仅在IgG不可逆热变性过程的动力学稳定中起作用。类似的稳定二硫键可以有效地合并到具有高拓扑相似性的其他抗体（亚）类中。嵌合体和人源化兔抗体的相关研究发现，这种二硫键确实可以提高抗体的热稳定性。兔抗体中κ轻链域间二硫键的发现，有助于指导耐高温稳定抗体的工程设计，以供临床开发。

参考文献
Raiji Kawade, Hiroki Akiba, Kevin Entzminger, et al. Roles of the disulfide bond between the variable and the constant domains of rabbit immunoglobulin kappa chains in thermal stability and affinity[J]. Protein Engineering, Design and Selection, 2018, 31:243–247.

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