查看Western blot实验问题:Western Blot的常见问题(FAQ)
本文介绍免疫印迹(Western Blot)的基本原理,实验步骤及常见问题(FAQ), 并提供免费PDF下载
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离,转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜(NC)上。固相载体可以吸附蛋白质,并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹(blot),用蛋白溶液(如5%BSA或脱脂奶粉溶液)处理,封闭NC膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体(一抗)处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,这样清洗除去未结合的一抗后,只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。
1.试剂准备
(1)甲醇
(2)转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L)
(3)一抗,二抗
(4)PBST,PBS,Tween-20
(5)显影液(5X):
自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中)
米吐尔 1.55g, 亚硫酸钠(无水) 22.5g, 碳酸钠(无水) 33.75g, 溴化钾 20.95g,补水至 500ml
(6)定影液:
自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)
硫代硫酸钠 240g, 亚硫酸钠(无水) 15g, 冰乙酸 12.6ml,硼酸 7.5g,钾明矾 15g(水温冷至 30℃以下时再加入),加水定容至 1000ml,室温保存
2. 材料准备
转膜用的夹子,两块海绵垫,一支滴管,两张滤纸,一张PVDF膜,转膜槽,转移电泳仪,摇床,计时器,磁力搅拌器,转子,Western blot 盒,一块SDS-PAGE胶,脱脂奶粉
培养的细胞(定性)
培养的细胞(定量)
3. 组织
使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。关于SDS-PAGE实验操作原理及FAQ参考SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备
1、准备:转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L)、转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切滤纸和膜时一定要戴一次性PE手套,避免手上的蛋白污染膜。转膜前,PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒,浸湿为止,在平衡液中平衡(甲醇的作用是固定大分子蛋白,使小分子物质易转移出去)
3、将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜浸泡在转移缓冲液中,然后取出SDS-PAGE胶,将浓缩胶轻轻刮去,并在胶的一角做一缺角作为标记以区分上样顺序。将胶在转膜缓冲液中浸泡5min左右,以平衡离子强度。
4、夹子打开平放底部黑色电极(阴极),放一张海绵垫片,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫片上放置1张转移缓冲液浸泡过的滤纸,对齐,然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡,必要时可滴加转膜液润湿。取出浸在转膜液中的凝胶平放在滤纸上,排除所有气泡。将PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝胶上,玻棒来回擀几遍排除所有气泡,注意在膜的正面作上标记(可以将膜的一角剪去或用签字笔在膜的边角上做记号)。在膜上盖一张转移缓冲液浸泡过的滤纸,同样须确保不留气泡。最后盖上另一张海绵垫,盖上阳极板(白色),夹紧。保证对凝胶有一定压力。
5、将夹子放入转移槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。转膜时将转移槽放入冰水中进行。转膜过程中电转液用磁力搅拌器搅拌。一般用恒压110V转移60min。对于大分子量的蛋白(超过120KD),时间约80min。特别要注意加强降温措施。
1、取膜,将膜正面朝上在1xPBST溶液中摇动五分钟,洗一次,移至含有封闭液(含10%脱脂奶粉的 瓶PBST 缓冲液;脱脂奶粉5g,PBST 100ml,溶解后 4℃保存。使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。)的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1小时。注:10%脱脂牛奶的作用:用大分子物质封闭非相关的蛋白结合位点,降低非特异性结合(抗体与膜),同时也使背景色不高。PBST:T为吐温,减少非特异性吸附,不影响抗体抗原的结合。
2、取出膜在1xPBST溶液中洗5分钟,摇动,洗两次,放入1xPBST缓冲液中(内含5%脱脂牛奶),同时加入一抗与二抗到缓冲液中,孵育60min。
3、用1xPBST洗至少三次,5min/次
4、化学发光,显影。显影液与水1:4,定影液与水1:9,发光液
注:显影液(5X):
自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中)
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠(无水) 22.5g
碳酸钠(无水) 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时,上述药品应逐一加入,待一种试剂溶解后,再加入后一种试剂。4℃保存。使用时
用自来水稀释至 1 倍。
定影液:
自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠(无水) 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g(水温冷至 30℃以下时再加入)
加水定容至 1000ml,室温保存
发光液:鲁米诺试剂2ml、过氧化氢1.3ml
5、在暗室中,将 1×显影液(50ml)和定影液(50ml)分别倒入塑料盒中;在红灯下取出 X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大 1cm);打开 X-光片夹,将膜放入X-光片夹,并将发光液均匀涂抹在膜上,之后把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上 X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为 1min 或 5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;曝光完成后,打开 X-光片夹,取出 X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。显影时间一般为 1~2min(20~25℃),温度过低时(低于 16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把 X-光片浸入定影液中,定影时间一般为 5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
1.显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
2.一抗,二抗的孵育时间因抗体不同可做适当的调整。
3.转膜时滤纸与胶,胶与膜,膜与滤纸之间不能有气泡,必须用玻棒擀走。有气泡会影响转膜效果。
4.把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动
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