单B细胞技术制备兔单克隆抗体

单克隆抗体是医学和生物学中最重要的生物工具之一，它彻底改变了一些疾病的诊断、治疗和靶向给药的方法。单B细胞抗体制备技术是单克隆抗体制备方法中最为直接但技术上最具挑战性的方法。该技术从单个B细胞直接“采样”免疫系统，从大量原代B细胞中检测和筛选特定的B细胞，扩增抗体基因，将基因克隆到表达载体中，并在哺乳动物细胞（如HEK293和CHO细胞）或细菌系统（大肠杆菌）中表达单克隆抗体。单B细胞抗体制备技术现已广泛用于生产人、小鼠、大鼠和兔单克隆抗体。本文以兔单克隆抗体为例，介绍使用单B细胞技术制备单克隆抗体的方法。

动物免疫

可用蛋白或与KLH偶联的多肽免疫新西兰白兔。多肽的序列应是目标抗原所特有的，并且与其他蛋白具有最小的同源性。每种免疫原至少免疫两只兔子。初次免疫皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）乳化后的免疫原。加强免疫的免疫原与不完全弗氏佐剂（IFA）混合制备而成。通常在初次免疫前采集兔子血清样本作为对照，用于评估之后抗血清效价。每次加强免疫后1周采集血清样本，通过ELISA、免疫印迹或免疫组化试验测试多克隆抗体的水平及其功能。选择测定结果较好（强特异性信号和低背景信号）的兔子进行B细胞分选。

B细胞分选

分选抗原特异性B细胞的方法很多。通过显微操作从组织中挑选标记过的B细胞和基于表面标记物的荧光激活细胞分选术是用于随机筛选B细胞的常用方法。流式细胞术也常用于分选抗原特异性B细胞。其他方法包括通过抗原包被的磁珠或微孔芯片阵列进行筛选，产生荧光焦点以分离抗原特异性浆细胞。

流式细胞术是分选抗原特异性B细胞最为有效的技术。这项技术已经成熟应用在人类B细胞的分选。人类B细胞表面上的多种标记物，可用于检测并分选免疫细胞的亚群。

使用流式细胞术从免疫动物中分选B细胞的方法与此相似。如利用流式细胞术分选源自小鼠脾脏的单个IgG+记忆B细胞：使用抗CD45R（B220）试剂富集小鼠B细胞，然后用抗CD19和抗IgG抗体进行标记，最后将荧光素标记抗原用于流式细胞术中特异性记忆B细胞的准确检测。

由于兔B细胞标志物较为缺乏，通过流式细胞术的鉴定和分选更具挑战性。在这种情况下，兔B细胞仅限于使用荧光标记抗原识别。同时，也可以使用反筛的方法，标记不需要的细胞，如T细胞和IgM⁺细胞的标记物，可以帮助分选到所需的IgG⁺细胞。

为了克服表面标记的局限性，有研究者采用了不同的策略。他们用抗IgG抗体和内质网（ER）特异性荧光染料对淋巴结细胞进行染色，如果这些细胞含有大量ER以产生抗体，则会被染色。他们将这种方法称为基于ER的抗原特异性浆细胞（ERIAA）鉴定，并将这种策略应用于鉴定人、小鼠、兔、大鼠和豚鼠的浆细胞。

单细胞抗体基因扩增、克隆和表达

扩增cDNA是B细胞分选后的下一步。如果培养B细胞，则将其裂解，从裂解物中提取总RNA和mRNA。如果未培养分选细胞，则将从单个细胞扩增cDNA。在逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）过程中，通过使用随机六聚体引物、oligo-dT或基因特异性引物逆转录mRNA合成cDNA。通常，单个细胞在96孔板中分选，细胞裂解和cDNA合成在细胞分选的原始孔中进行。这样更容易处理大量样品。然而，在移液过程中，必须注意尽量减少相邻孔之间交叉污染的风险。

VH和VL的全长基因转录物通常在两轮PCR期间通过巢氏或半巢氏RT-PCR以第一链cDNA为模板扩增。正向引物可以是与相应的重链和轻链前导序列互补的序列或序列组合。反向引物可以是重链和轻链恒定区域内的序列或序列组合。例如，在兔IgG中，IgG只有一个亚类，重链恒定区只有一种基因。而兔IgG轻链70%以上为κ1，其余为κ2和λ。因此，在设计PCR引物时需要考虑这些细节。使用巢氏引物的第二轮扩增是为了增加特异性，并为随后的可变区克隆增加限制性位点。

克隆扩增可变区基因，表达抗体的方法有多种。一种策略是将PCR片段克隆到带有表达元件的质粒载体中，该表达元件包含前导序列和重链或轻链的恒定区。载体还需要具有转录和翻译所需的所有必要元素，如启动子序列和poly (A)序列。将载体转化到大肠杆菌中以制备足够的DNA用于转染。然后，将含有重链和轻链表达基因的质粒共转染到哺乳动物表达细胞中。重链和轻链由细胞表达，并组装为完整抗体结构释放到培养基中。

不依赖序列和连接的克隆方法（SLIC）是克隆编码可变区片段的一种不同方法。将携带重链或轻链恒定区序列的质粒，所有转录和翻译所需的元素都用限制酶消化。使用外切酶如T4 DNA聚合酶在该线性质粒和包含VH和VL的DNA片段中产生互补单链DNA突出末端。然后将它们在体外结合以产生HC和LC表达质粒。将质粒转染哺乳动物细胞，如HEK293进行抗体表达。

抗体的定量和表征

适当的培养时间后收获抗体上清液，确定产生抗体的数量和活性。可通过抗原结合ELISA试验确定抗体的特异性，也可通过免疫印迹进行检验。

小结：单B细胞技术的优势

在过去一两年中，单B细胞技术作为一种创新技术，已用于生产多种应用的单克隆抗体。与生产单克隆抗体的其他技术相比，单B细胞技术具有几个优点：

1. 与杂交瘤技术中低效的融合不同，单B细胞技术极为高效，并且保留了大部分抗体库。这有利于产生具有更高多样性的抗体。

2. VH和VL均从单个细胞中扩增。与展示方法不同，保持了抗体的天然同源配对和发育，保证获得抗体具有更高亲和力、稳定性和特异性。

3. 单B细胞技术会对VH和VL的DNA序列进行测序。因此，生产过程不依赖于细胞株，不存在污染和失去产生抗体的细胞的风险。

4. 不需要保存B细胞。

表1 常用抗体制备方法的优劣势对比

参考文献
Rashidian J, Lloyd J. Single B Cell Cloning and Production of Rabbit Monoclonal Antibodies. Methods Mol Biol. 2020;2070:423-441. doi: 10.1007/978-1-4939-9853-1_23.

相关服务

相关阅读

• 兔单抗杂交瘤技术的发展