竞争ELISA法测定抗体亲和力

抗体亲和力测定的方法很多,竞争ELISA法是一种简便易行的亲和力测定方法,下载本文主要介绍竞争ELISA法测定抗体亲和力的原理、操作步骤以及注意事项。如果想了解更多抗体亲和力的测定方法,查看抗体亲和力测定方法介绍

原理

抗原抗体的结合是一个可逆的反应:A+B ⇋AB(A表示抗体,B表示抗原,AB表示抗原抗体结合物)。
当反应达到平衡时,解离常数Kd=[A][B]/[AB],[AB]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度,[A]表示反应平衡时游离抗体的浓度,[B]表示反应平衡时游离抗原的浓度。
① 当反应体系中抗体很少,而抗原过量时,反应平衡后[AB]>[A];
② 当反应体系中抗原量很少,而抗体过量时,反应达到平衡后[AB]<[A];

③ 当反应体系中抗原抗体的量刚好合适时,反应达到平衡后处于半饱和状态,此时[AB]=[A],则Kd=[A][B]/[AB]=[B]。

在半饱和状态下,如果抗体的浓度很低,反应消耗的抗原很少,则反应后游离的抗原浓度[B]约等于总的抗体浓度[B],此时Kd=[B]≈[B]。因此,只要在抗体浓度较低的情况下,找到可以在反应平衡后达到半饱和状态的抗原浓度[B],便可以得到解离常数。
竞争ELISA测抗体亲和力原理

操作步骤

竞争ELISA法测出的Kd值的准确性,依赖于一个大前提:将反应混合物加入包被抗原板后,包被抗原与游离抗体的结合不会破坏抗原抗体反应体系的平衡状态(如果抗原板中抗原浓度过高,结合的游离抗体超过了一定的量,抗原抗体反应体系的平衡会被破坏,此时测得的OD值偏大,最终导致结果偏大)。通常允许抗原板结合的最大游离的抗体量为10%。在进行ELISA法检测抗体亲和力实验时,需要确保抗原不会破坏反应体系的平衡。通常可以用以下操作步骤来确定该包被抗原的浓度是否过高:

  • 包被抗原板,然后用3%的MPBS室温封闭2h,PBS洗涤;
  • 准备梯度稀释的抗体溶液(稀释前的抗体浓度与竞争ELISA实验中的抗体浓度相同),每个稀释液取100mL;加入第一块抗原板中,一式三份(见下图a),孵育1个小时;
  • 使用微量移液器小心移出第一块板中抗体稀释液,将三份相同浓度的稀释液放入一个管中,每个稀释液取100mL加入第二块抗原板中,一式两份(见下图b),孵育1个小时,PBS洗涤;
  • 加入酶标二抗,孵育1个小时,PBS洗涤;
  • 每个孔中加100μl底物,显色30min;
  • 终止显色反应,测定各个孔OD值;
  • 将得到OD值与对应的抗体浓度结合,分别就第一块抗原板与第二块抗原板做两条拟合曲线(见下图c);

竞争ELISA测抗体亲和力预实验流程

  • 对比两条曲线,如果之间的差值小于10%,则说明该包被抗原的浓度符合要求,如果大于10%,则说明该包被抗原浓度过高,需对包被抗原进行稀释后重新测定。

竞争ELISA测抗体亲和力实验流程

  1. 包被抗原板,然后用3%的MPBS室温封闭2h,PBS洗涤。
  2. 在一排试管中,利用有限稀释法建立从0.1 nmo/L~1μmol/L浓度梯度的抗原PBS溶液,加入抗体溶液(浓度≤0.5μmol/L)使总体积为100μl。
  3. 室温孵育30min后,加90μl反应混合物到前述已包被抗原的微孔中,微孔中预先加人30%的MPBS 30μl后孵育,但时间不宜超过10min(时间不宜过长,过长会导致混合物中反应平衡体系被破坏,最终实验数据不准确)。充分洗涤抗原板。
  4. 加入酶标二抗,孵育1h,PBS洗涤。
  5. 加入显色底物显色,显色30min后加入终止液停止反应,进行OD值读数。

抗原浓度较低时,反应平衡后[A]较大,被抗原板捕获的游离抗体多,信号强;当抗原浓度高时,反应平衡后[A]较小,被抗原板捕获的游离抗体少,信号弱;当抗原浓度髙到一定程度时,将没有信号。在最强信号一半时的状态为半饱和状态,此时[A]=[AB],Kd=[B]≈[B]总。将测得的OD值记录,结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线,最终找到最强信号一半的点,对应的抗原浓度即解离常数Kd

注意事项:

酶标抗体建议不要使用HRP偶联抗体,竞争ELISA法测抗体亲和力实验是在抗体浓度很低的条件下进行,利用HRP偶联抗体并不能很好的获得信号。为了获得更好的信号,建议使用AP偶联的鼠单克隆抗体。
德泰提供抗体亲和力检测服务,可以准确的测定抗体的亲和力。

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