禽类IgY抗体在诊断、治疗中的应用

禽类抗体在生命科学与医学领域中的应用越来越受到关注。由于禽类与哺乳动物系统的遗传距离、抗体多样化的机制以及IgY在蛋黄中沉积的方式,使得禽类特别是鸡作为免疫宿主具有许多优势。首先,禽类与哺乳动物间的遗传距离较远,对哺乳动物源的抗原物质容易产生强免疫应答,且可以针对更多哺乳动物抗原表位形成抗体。其次,IgY具有较强的耐热、耐酸、耐高渗性能以及一定的抗酶解能力,这可能是IgY重链上额外的二硫键提供了更高的分子稳定性。CDR3区是决定结合抗体亲和力和特异性的主导区域。与IgG相比,IgY重链CDR3残基数更多,这使得IgY的亲和力和特异性更好。最重要的是,IgY的Fc区不与哺乳动物的Fc受体、类风湿因子(RF)、CF(尤其是C1q和C3)以及蛋白A、蛋白G、蛋白L发生相互作用,可以避免免疫分析中的显著干扰和交叉反应。基于以上优势,禽类IgY抗体开始广泛运用于免疫诊断或治疗性抗体药物的开发。

IgY在免疫诊断中的应用

在免疫检测中,样本中存在的内源性干扰物质,如异嗜性抗体(HA)、人抗动物抗体(HAAA)和类风湿因子(RF)会通过与抗体的非特异性结合,降低检测的灵敏度和特异性,导致假阳性或假阴性结果。此外,通过抗体Fc受体或凝集素的非抗原依赖性特异性结合或其他基于非免疫球蛋白的相互作用,如由补体因子介导的相互作用,也可能导致检测结果的偏颇。据统计,异嗜性抗体对检测结果的干扰变化范围从1%至80%。对超过11000份检测CEA的血清进行更彻底的分析后发现,约4%的检测结果可能是错误的。消除异嗜性抗体干扰的方法包括去除阻断干扰性抗体,然而使用这类方法想要完全解决这些问题的可能性不大。

IgY的最有趣且不寻常的特征就是Fc区不与哺乳动物的Fc受体、类风湿因子(RF)、CF(尤其是C1q和C3)以及蛋白A、蛋白G、蛋白L发生相互作用。这使得IgY特别适合应用于容易产生不必要交叉反应的检测。如在一项蛋白质组学研究中,使用特异性IgY预处理血清样品,中和高丰度血清成分,可以改善下游分析。在另一项研究中,使用特异性IgY作为封闭试剂,简化了低丰度血清蛋白的检测和疾病标志物候选物的发现。

表1 IgY在免疫诊断中的优势

哺乳动物IgG 禽类IgY
主要来源 血浆 蛋黄
哺乳动物抗原抗体滴度 通常较低 通常较高
与Protein A/Protein G 结合 ++++
与哺乳动物细胞Fc受体结合 ++++
免疫复合物激活哺乳动物补体系统 ++++
抗体生产能力 90天免疫/50~70mL血清 500~700 mg IgG 90天免疫/60个鸡蛋
3-6 g IgY
应用 RIA、IRMA、ELISA、Western blot、FACS等 RIA、IRMA、ELISA、Western blot、FACS等

IgY在免疫疗法中的应用

禽类和哺乳动物之间的系统发育距离确保了禽类对哺乳动物源抗原的强免疫反应。这种特征有利于产生针对哺乳动物肿瘤抗原的IgY。Amirijavidv等人针对TRAIL受体TRAIL-R2(DR5)胞外段上的21个氨基酸制备了高度特异性的IgY。这种IgY与受体胞外肽段结合后,激活人乳腺癌细胞MCF7中的DR5受体,作为TRAIL激动剂诱导细胞凋亡。YAN等通过构建靶向HER2的IgY与单壁碳纳米管(SWNT)的偶联复合物,在表达HER2的SK-BR-3细胞和HER2阴性的MCF-7细胞的体外模型中证明了该复合物检测和选择性破坏癌细胞的双重功能。这些研究表明,针对肿瘤抗原产生的IgY是更具选择性的癌症治疗替代方案。

IgY在禽畜疫病防治中的应用

抗生素在养殖业中一直用于促进生长(亚治疗剂量)、疾病预防(预防剂量)和治疗感染。饲料中抗生素的过量使用和误用导致了动物产品中药物残留的问题和耐药性的增加。IgY作为一种预防和控制禽畜疾病的手段引起了相当的关注。与哺乳动物IgG治疗相比,IgY摆脱了使用抗体口服免疫疗法极高的成本约束——母鸡可以看作是生产抗体的小型“工厂”:一只母鸡通常每年产下约300个鸡蛋,每个蛋黄含有50-100mg的IgY,其中2%至10%是特异性抗体。因此,免疫一只母鸡每年可产生超过22500 mg的IgY,相当于4.3只兔子一年产生抗体的量。饲养母鸡的维护成本也低于兔子等哺乳动物。

IgY抵御病原体活性的机制概述如下:

1.凝集

使用IgY处理后,可以观察到细菌生长或定植被抑制,这种作用并非是对单个细菌的直接影响,而是由于IgY的两个Fab臂的空间位阻,阻碍了细菌的交联,从而导致细菌凝集。

2.抑制黏附

一些体外研究表明,抑制黏附是特异性IgY抵消病原体活性的主要机制。暴露在革兰氏阴性菌表面的特定成分,如外膜蛋白、脂多糖、菌毛和鞭毛,它们是细菌定植的关键因素,可以被相应的特异性抗体识别和结合。这种结合可能会阻断或损害细菌生长相关功能的成分,抑制细菌生长。

3.调理后吞噬作用

有研究发现IgY改善了中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬作用。与此类似,IgY存在的情况下,乳巨噬细胞或多形核中性粒细胞对大肠杆菌的吞噬活性显着增加。这些结果表明,IgY增强了吞噬活性。通过与特异性IgY结合,观察到细菌表面结构改变,这些变化可以通过细菌表面电子云和/或电场的变化来解释,导致细菌细胞更容易受到吞噬作用的影响。

4.毒素中和

金黄色葡萄球菌荚膜是引起牛乳腺炎发作的重要致病菌之一。IgY可以阻止乳腺上皮细胞对金黄色葡萄球菌的内化,这表明IgY控制牛乳腺炎的主要途径为中和毒素活性,而不是直接抑制生长。

表2 IgY在禽畜疫病防治中的应用

病原体名称 IgY的作用 文献来源
轮状病毒 预防牛轮状病毒引起的犊牛腹泻 Kuroki et al. (1994)
预防鼠轮状病毒 Yolken et al. (1988)
预防人类轮状病毒引起的小鼠胃肠炎 Ebina (1996)
预防和治疗轮状病毒诱导的小鼠胃肠炎 Hatta et al. (1993)
轮状病毒感染体外预防:使用IgY对抗重组HRV外壳蛋白VP8* Kovacs-Nolan et al. (2001)
冠状病毒 保护新生犊牛免受牛冠状病毒(BCV)引起的腹泻 Ikemori et al. (1997)
大肠杆菌 预防新生仔猪K88+、K99+、987P+ETEC感染 Yokoyama et al. (1992)
保护新生犊牛免受致命的肠道大肠杆菌病(ETEC K99)的侵害 Ikemori et al. (1992)
抑制ETEC K88对仔猪肠黏液的黏附 Jin et al. (1998)
预防新生儿和早断奶仔猪ETEC K88+感染 Marquardt et al. (1999)
沙门氏菌 保护小鼠免受肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的侵害 Yokoyama et al. (1998)
预防暴露于鼠伤寒沙门氏菌或都柏林沙门氏菌的新生犊牛发生致命感染 Yokoyama et al. (1998)
抑制肠炎沙门氏菌与人肠道细胞的黏附 Sugita-Konishi et al. (1996)
耶尔森氏菌 保护虹鳟鱼免受鲁氏耶尔森氏菌感染 Lee et al. (2000)
爱德华兹氏菌 预防迟缓爱德华氏菌对日本鳗鱼的感染 Stevenson et al. (1993)
IBDV 保护雏鸡免受传染性法氏囊病毒的侵害 Gutierrez et al. (1993)
葡萄球菌 抑制金黄色葡萄球菌A型肠毒素的产生 Sugita-Konishi et al. (1996)
假单胞菌属 抑制绿脓杆菌的生长 Sugita-Konishi et al. (1996)

参考文献
[1]Dias da Silva W, Tambourgi DV. IgY: a promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy. Vet Immunol Immunopathol, 2010, 135(3-4):173-80.
[2]Spillner E, Braren I, Greunke K, et al. Avian IgY antibodies and their recombinant equivalents in research, diagnostics and therapy. Biologicals, 2012, 40(5):313-22.
[3]Pereira EPV, van Tilburg MF, Florean EOPT, et al. Egg yolk antibodies (IgY) and their applications in human and veterinary health: A review. Int Immunopharmacol, 2019, 73:293-303.
[4]Xu Y, Li X, Jin L, et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: a review. Biotechnol Adv, 2011,29(6):860-8.

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禽类IgY结构、功能与特性

免疫球蛋白Y(IgY)是一种广泛存在于鸟类、爬行动物、两栖动物和肺鱼中抗体同种型,它在结构和功能上与哺乳动物的IgG和IgE同源,被认为是IgG和IgE的进化前体。禽类IgY在功能上与哺乳动物IgG相似,曾被提议应命名为“禽类IgG”。(本文禽类IgY抗体均特指鸡IgY)。

IgY与不同物种的IgG的结构比较

图1 IgY与不同物种的IgG的结构比较

IgY与IgG的结构差异

免疫球蛋白呈对称的Y型结构,通常由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。哺乳动物IgG重链恒定区由CH1、CH2和CH3组成,其中CH2和CH3构成Fc区。轻链只有一个恒定区,用CL表示。可变区片段Fv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。VH和VL分别与CH1和CL相连,共同组成Fab区。重链和轻链之间通过CH1和CL所含半胱氨酸形成的二硫键相连,Fab和Fc通过位于重链的CH1和CH2之间的铰链区相连,两条重链通过铰链区内的二硫键相连,最终形成一个约150 kDa的抗体分子。

哺乳动物IgG和禽类IgY在结构上的差异主要体现在恒定区。IgY的CH1和CH2之间缺乏铰链区,这限制了IgY的柔韧性,铰链区中连接两条重链的二硫键也相应缺失。IgY连接两条重链的二硫键位于CH2,该区域存在四个典型的半胱氨酸,其中两个形成重链链间二硫键,其余两个形成链内二硫键。除此之外,IgY存在额外的CH4域。因此IgY的分子量(180 kDa)略高于IgG。

IgG和IgY的典型结构

图2 IgG和IgY的典型结构

IgY的序列特点

通过对未免疫处理鸡抗体库VH序列的分析发现,与IgG相比,IgY VH CDR3残基数较多;此外,IgY VH CDR3含有非规范内的半胱氨酸残基,这些残基可形成链内二硫键,赋予结构额外的稳定性,这一特征在IgG VH CDR3中不明显。

鸡、小鼠、人的CDR3长度分布比较

图3 鸡、小鼠、人的CDR3长度分布比较
红色:未免疫鸡VH CDR3长度分布
灰色:小鼠VH CDR3长度分布
黑色:人类VH CDR3长度分布

至于VL链,禽类只表达λ轻链,而哺乳动物主要表达κ轻链。IgY V与哺乳动物IgG V在序列和结构上具有显著的同源性。一个显著的区别是,IgY V CDR1的标准结构要比IgG的明显要短。这种差异在分析种系和免疫处理后鸡的V CDR时也被观察到了,因此推测这与抗原驱动因素无关。这可能出于进化压力,这样IgY较短的VL CDR1可以与较长的VH CDR3之间做到结构互补。

禽类抗体多样性的产生机制

禽类免疫球蛋白种系基因包括VL基因位点上的V基因片段和J基因片段,以及VH基因位点上额外的D基因片段。与人类、小鼠VH基因家族和VL基因家族中存在多个种系不同,禽类VH和VL基因家族只存在一个功能性的基因片段。因此禽类抗体中虽然存在V-D-J和V-J重排,但重排过程对抗体序列多样性的贡献很小。禽类抗体的多样性主要是通过V-D-J和V-J重排后的基因转换和体细胞超突变机制产生的。

基因转换是指供体基因片段单向转移到同源受体基因片段,导致供体序列在该区域复制的过程。受体片段可发生多次转换事件,这是禽类IgV基因库多样性产生的重要机制。位于5’端上游的80~100个重链假基因(ψVH)和25个轻链假基因(ψVL)与重排的VH和VL基因片段具有同源性,可以为V区受体提供供体序列。大多数基因转换事件发生在VH的D基因片段,这是CDR3多样性的保证。而VL基因转换仅发生于VL区而不延续到JL区。基因转换过程会在个体VH和VL库中产生大量的排列,再加上重轻链的配对,可以产生约3×109种组合的抗体库。

产生多样性的另一种机制称为体细胞超突变。体细胞突变在分裂细胞中发生的频率较低,但它在B细胞中发生频率较高(单个细胞分裂过程中,每103个核苷酸对中就有一个突变发生)。这种比其他细胞高一百万倍的点突变率仅出现于重排的Ig基因位点。点突变除了大幅增加抗体库多样性外,还使得对特定抗原具有高亲和力的免疫球蛋白出现。

IgY Fc的功能与特性

与其他抗体同种型类似,IgY除了可变区具有抗原中和能力外,Fc区也具有相当一部分的免疫调节功能。IgY的Fc区是Gallus Gallus Fc受体(ggFcR)和鸡免疫球蛋白样受体簇(CHIR)及其同源物的配体。在属于CHIR簇的受体中,研究最多的是CHIR-AB1。IgY-ggFcR相互作用类似于受体配体比例为1∶1的IgG-Fc-FcγR相互作用,而IgY-CHIR-AB1相互作用类似于受体配体比例为2∶1的IgA-FcαR1受体相互作用。

由于残基基团和/或结构构象的差异,IgY的Fc区不能与哺乳动物的Fc受体、类风湿因子(RF)、CF(尤其是C1q和C3)以及蛋白A、蛋白G、蛋白L发生相互作用。由于IgY不能与上述哺乳动物免疫调节蛋白结合,可以避免免疫测定中哺乳动物免疫复合物的天然相互作用所带来的显著干扰和交叉反应。使用IgY还可以避免哺乳动物Ig的疗法可能产生的不良继发免疫反应。此外,加深对IgY与鸡免疫调节蛋白的相互作用的理解可以进一步优化多克隆/单克隆IgY检测或纯化方法。如可以通过CHIR1-AB1-哺乳动物Fc融合蛋白来简化IgY检测方法:使用预制或商业化的抗哺乳动物Fc二抗检测抗原结合的IgY,这样无需制备或购买新的抗IgY二抗。

表1 IgY、IgG和IgE与特定受体/配体的不同相互作用区域

受体和/或配体 相互作用区域/特征
IgY IgG IgE
CHIR-AB1 CH3-CH4域间
ggFcR CH2-CH3域间
FcRY CH3-CH4域间
IgG-FcγR CH2-CH3域间,CH2铰链区
IgE-FcεR CH3-CH4域间
类风湿因子(RF) CH2-CH3域间 可能为CH3-CH4域间
补体因子(CF) CH2-CH3域间,CH2铰链区
蛋白A CH2-CH3域间,可能涉及CH2铰链区 CH2 N端
蛋白G CH2-CH3域间
蛋白L Kappa轻链 Kappa轻链

IgY的稳定性

IgY具有高稳定性,在室温下可保持活性6个月,在4°C下可保持活性5年,在70°C下可以保持相对稳定15分钟;并且在pH值为4~11时具有高活性。有研究从结合活性和构象变化两方面比较兔IgG和鸡IgY的分子稳定性。结果发现,与兔IgG相比,鸡IgY在碱性和酸性pH下表现出更高的稳定性,同时在高温条件下(45℃,60℃)保持稳定的时间更长。IgY重链上的额外结构域在提供更高的分子稳定性方面发挥了重要作用。

参考文献
[1]Wu L, Oficjalska K, Lambert M, et al. Fundamental Characteristics of the Immunoglobulin VH Repertoire of Chickens in Comparison with Those of Humans, Mice, and Camelids. The Journal of Immunology, 2012, 188(1): 322-333.
[2]Lee W, Syed Atif A, Tan SC, et al. Insights into the chicken IgY with emphasis on the generation and applications of chicken recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods, 2017, 447: 71-85.
[3]Yakhkeshi S, Wu R, Chelliappan B, et al. Trends in industrialization and commercialization of IgY technology. Front Immunol. 2022, 13:991931.
[4]Gandhi S, Alshehri SM. Molecular stability of the rabbit and chicken egg yolk immunoglobulins. Front Biosci (Elite Ed), 2021,13(1):185-194.

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抗独特型抗体在抗体药物PK/ADA上的应用

在过去的30年里,抗体药物作为一种重要的生物技术药物用于各种疾病的治疗,包括癌症、感染、自身免疫疾病等,取得了重大的进展。作为抗体药物复杂而漫长的研发过程的一部分,药代动力学(pharmacokinetics, PK)研究和免疫原性(ADA)检测贯穿了其临床试验的各个阶段。抗独特型抗体(Anti-idiotype antibodies,Ald)是一种能够特异性结合待测抗体位于可变区独特位的抗体,在抗体药物研发过程中药代动力学研究和免疫原性检测中发挥着重要作用。

药代动力学研究

药代动力学研究通过定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄的过程,为患者用药的有效性和安全性提供依据。和传统小分子药物相比较,抗体药物的血管通透性较差、代谢过程以蛋白质分解为主,并且与靶点的结合更为紧密,因此其PK行为与小分子药物存在极大的差异。在抗体药物的药代动力学研究中,除了研究内容与小分子药物相比存在不同的侧重点外,生物分析方法与小分子药物也有所差异。小分子药物的生物分析方法主要为液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用技术(GC⁃MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC⁃MS/MS)等。而抗体药物常用的分析方法有配体结合分析法(ligand binding assays, LBA),如免疫分析法、生物检定法以及液相色谱-质谱法(LC-MS)。目前免疫分析法为抗体药物分析的主流方法,该分析方法可以对样本进行高通量检测,灵敏度可达ng级别。

抗独特型抗体是抗体药物PK研究的关键工具试剂。根据结合模式的不同,抗独特型抗体可分为抗原阻断型、抗原非阻断型和药物靶标复合物型。采用不同的抗独特型抗体设计出不同的检测形式(assay format)可以有针对性地检测各种形式的抗体药物,即游离型、结合型或抗体药物总量。

抗原阻断型

抗原阻断型

互补位特异性
阻断抗原抗体结合
检测游离型抗体药

抗原非阻断型

抗原非阻断型

互补位非特异性
不阻断抗原抗体结合
检测抗体药总量

药物靶标复合型

药物靶标复合型

特异性结合药物靶点复合物
不阻断抗原抗体结合
检测结合型抗体药

抗原捕获型 独特型抗体捕获型 夹心ELISA
检测示意图 anti-idiotype-antibodies-PK

anti-idiotype-antibodies-PK

anti-idiotype-antibodies-PK

常用抗体药物PK检测形式示意图

PK研究的分析方法除需具备在复杂生物基质中检出和监测(追踪)被分析物(母体药物和/或代谢物)的能力外,同时还应满足特异性、灵敏度、准确度和精密度以及适当的定量范围等要求。抗体药物与内源性分子相同或者相似,可能带来交叉反应,提高了分析难度。德泰生物抗独特型抗体开发服务基于SingleB®快速单抗开发平台,支持浆细胞和记忆B细胞双筛选,获得抗体多样性、特异性与亲和力更优,保证下游试剂盒开发灵敏度,为抗体药物研发解除限速。

免疫原性分析

免疫原性是指能够刺激机体免疫系统引起免疫应答的特性。免疫原性检测是药物研发过程中必不可少的一步,在临床前和临床阶段均需要开展。具有免疫原性的药物可能诱发机体产生不必要的免疫反应,能形成抗药抗体(anti-drug antibody, ADAs),包括药物结合抗体(binding antibodies, BAbs)和中和抗体(neutralizing antibody, NAbs)。前者会引起患者强烈的免疫反应,甚至危害患者生命安全,后者具有药物中和能力,能够抑制生物药的生物活性,减弱其药效。

免疫原性研究主要聚焦在抗药抗体的检测和表征上,通常应获得抗药抗体的发生率、滴度、存续时间和中和能力数据。有些情况下,需要对抗药抗体进一步表征,如同种型和亚型或者与相关内源性蛋白的交叉反应性。抗药抗体的检测通常应采用多层级分析方法,首先对所有样本进行筛选试验,之后对疑似抗体阳性样本的特异性进行确证试验,对已确证抗体阳性的样本进行滴度试验,以及对抗体中和活性进行检测。其中在已确证抗体阳性的样本中,有时还应考虑对抗体同种型、亚型和结合表位进行检测。

免疫原性多层级检测决策树如下图所示。

免疫原性多层级检测决策树

有效评估抗体药物的免疫原性,开发可靠的评估检测方法尤为重要,较为常用的有直接法、桥联法等。两种分析方法均有优点和不足,包括检测灵敏度、检测范围、检测不同免疫球蛋白的能力以及试剂的可获得性。

作为评估方法学性能的关键试剂,阳性对照抗体直接影响检测方法的灵敏度。阳性对照抗体可以购买通用商品化检测试剂,也可以通过免疫动物获得抗独特型抗体作为阳性对照抗体。相比商品化的检测试剂,使用抗独特型抗体开发的分析方法特异性、灵敏度、检测范围更好。一般选择抗独特型多克隆抗体作为阳性对照抗体。作为备选,有时也可选用单个或多个单抗的组合作为阳性对照抗体。

直接法 桥联法
检测示意图 anti-idiotype-antibodies-ADA

anti-idiotype-antibodies-ADA

优点 可检测低亲和力ADA 无种属特异性
缺点 有种属特异性 易受药物浓度,可溶性靶点干扰
不易检测到低亲和力ADA

常用抗体药物ADA检测形式示意图

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抗独特型抗体开发

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抗独特型抗体

抗独特型抗体

抗体是体液免疫的最主要成分,是免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞或记忆B细胞增殖分化形成的浆细胞产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)分子。作为具有生物学功能的大分子蛋白质,抗体既可以通过其抗原结合部位识别并结合相应的抗原,同时也具有抗原性,可以刺激机体产生相应的抗体。

同种型、同种异型和独特型

由于抗体产生的遗传基础不同,因而不同抗体分子的抗原性存在差异。利用血清学方法可以测定和分析不同抗体分子的抗原性并将其进行分类,称之为抗体的血清型。抗体的血清型可以分为同种型(Isotype)、同种异型(Allotype)和独特型(Idiotype, Id)。

同种型 同种型,指同一种属所有个体抗体分子共有的抗原特异性标志,其表位存在抗体的恒定区。
同种异型 同种异型,指同一种属不同个体间抗体分子所具有的不同抗原特异性标志,其表位广泛存在于抗体的恒定区。
独特型 独特型,指每个抗体分子所特有的、存在于可变区的抗原特异性标志。独特位可位于抗体分子V区的互补决定区(CDR),也可位于抗体分子V区的骨架区(FR)。

什么是抗独特型抗体?

独特型由若干表位组成,称为独特位(idiotope),它可刺激机体产生相应的抗体,即抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody, AId)。独特型和抗独特型抗体可以形成复杂的网络,在免疫调节中占有重要地位。

抗独特型抗体的类型

根据抗独特型抗体与独特型反应的特点,可将抗独特型抗体分为Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2δ四类。

Ab2α 由位于Id骨架区的独特位诱导产生,与Id的结合不影响与抗原的结合,属于抗原非抑制性的抗独特型抗体。
Ab2β 由位于Id抗原结合位的独特位诱导产生,这类抗独特型抗体在三维结构上与抗原类似,Ab2β和Id的结合可以完全阻断抗原与Id的结合,这类抗独特型抗体在实际应用上具有重要意义。
Ab2γ 由靠近抗原结合位的独特位诱导产生,与Id的结合可以抑制抗原与Id的结合。与Ab2β不同的是,Ab2γ在三维结构上与Id原始抗原的结构并不相似。Ab2γ在与Id结合后,可导致Id可变区三维结构改变,干扰抗原与Id的结合。
Ab2δ 既能识别Id骨架结构上的独特位,同时也能识别抗原上具有交叉反应结构的表位,是一类比较少见的抗体。

根据结合模式的不同,可将抗独特型抗体分为抗原阻断型、抗原非阻断型和药物靶标复合物型。

抗原阻断型

抗原阻断型

互补位特异性
阻断抗原抗体结合

抗原非阻断型

抗原非阻断型

互补位非特异性
不阻断抗原抗体结合

药物靶标复合型

药物靶标复合型

特异性结合药物靶点复合物
不阻断抗原抗体结合

抗独特型抗体的应用

根据免疫网络学说,作为“内影像”的抗独特型抗体在结构和功能上能模拟相应抗原,在一定程度上替代原始抗原,因此可以将抗独特型抗体作为抗原的替代物用于免疫学研究及基础和临床医学研究,而且在传染性疾病的防治机理研究和肿瘤治疗等应用研究中也取得了重大进展。

1.寻找病毒受体

病毒受体指位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,大多数属于蛋白质。病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一。根据Jerne的免疫网络学说,作为抗原“内影像”的抗独特型抗体在结构和功能上能模拟相应的外来抗原,因此能够用于模拟病毒寻找细胞受体蛋白。通常选择病毒的中和抗体制备抗独特型抗体,所获得的抗独特型抗体能很好地模拟病毒抗原。

2.制备受体拮抗剂

受体拮抗剂指能与受体结合,但不具备内在活性的一类物质,也指与受体有较强的亲和力而无内在活性的药物。例如传统的生长激素受体拮抗剂主要分为两类,生长激素类似物和抗生长激素受体抗体。抗独特型抗体可以代表一种制备拮抗剂的新策略并应用于其他细胞因子和生长因子拮抗剂的研究。

3.疫苗研究

抗独特型抗体Ab2β作为抗原的模拟物,可代替病原体诱导机体产生抗病原体的特异性免疫应答,即所谓抗独特型疫苗。抗独特型疫苗是免疫调节网络学说发展到新阶段的产物,无论抗原是细菌、病毒还是寄生虫,或是蛋白质还是多糖,都可用其“内影像”抗体来诱导机体的特异性免疫应答,从而产生保护性免疫应答。目前,已有许多用抗独特型抗体制备的实验室疫苗接种动物后能使免疫动物抵抗病原体的感染。

除病原防治领域外,抗独特型肿瘤疫苗的研究也逐渐成为研究热点。无论是最初的鼠源性Ab2β,还是Ab2β的Scfv疫苗以及与DC、细胞因子等联合制成的疫苗,抗独特型抗体的功能在不断得到改进和完善,在大多数动物试验研究中都能诱导出抗肿瘤的特异性细胞免疫和体液免疫,在临床试验中也取得了较好的疗效。

4.诊断试剂

抗原是临床免疫诊断中最为关键的试剂之一,但由于某些天然抗原的自然含量极少,或者纯化抗原极其困难,或者抗原本身具有危险性等原因,难以获得必要的天然抗原。用抗独特型抗体替代这些抗原作为诊断试剂,不仅可以克服这些困难,而且具有重复性强、稳定性好、可标准化等优点。

5.自身免疫病研究

自身免疫病是机体产生对自身成份的免疫应答并造成病理损害而引起的一系列疾病,常与自身隐蔽抗原的释放、自身反应的T细胞克隆激活以及由于具有与自身交叉反应抗原的病原体感染有关。随着免疫网络学说和抗独特型抗体研究的发展,进一步提示了独特型网络维护机体免疫系统自身稳定的一个重要功能,如果调节失常,就可能导致自身免疫病的发生。

6.药代动力学检测

抗体药是生物技术药物的重要组成部分,其药代动力学(PK)检测是生物技术药物开发过程中的重要挑战之一。PK检测通过检测抗体药在动物或人体内的血药浓度-时间曲线、组织分布、代谢转化排泄等,对药物的临床安全性及有效性进行评估,确定药物初始使用剂量,指导临床用药。抗独特型抗体是抗体药PK分析的关键工具试剂,可以用于检测血液中抗体药的含量,包括游离型、结合型及总量。抗原阻断型抗独特型抗体可以检测游离型抗体药,抗原非阻断型抗独特型抗体可以检测抗体药总量,而药物靶标复合型可以检测检测结合型抗体药。

7.免疫原性分析

药物的免疫原性,通常是指其诱发抗药抗体(Anti-drug antibody, ADA)反应的能力。抗体药作为外源性蛋白,不可避免地会激活机体自身地免疫反应,诱导产生抗药抗体,从而影响抗体药的安全性和有效性。抗体药人源化可以减少非人源成分带来的各种风险,但是仍会产生一定的抗药抗体。

免疫原性分析是生物技术药物临床研发中的重要部分,通常是通过对药物引起的抗药抗体的检测和确认来评估药物的免疫原性。有效评估抗体药物的免疫原性,开发可靠的评估检测方法尤为重要。免疫原性筛选通常使用操作方便快捷、能够高通量测定的ELISA方法。其中桥式ELISA法最为常用,该方法是利用包被在酶标板上的抗体药物捕获血清样品中的ADA,然后加入生物素标记的抗体药物,使其与ADA结合。接者用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联试剂作为检测试剂,加入酶反应底物显色后,再利用酶标仪进行检测。此法的优点是能检测各类抗体的亚型,可高通量检测。在分析患者样本中是否存在抗药抗体时,常使用多克隆抗独特型抗体作为阳性对照。

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细胞因子释放相关综合征(CRRS)常见于T细胞抑制剂(TCE)的临床试验中,通常由T细胞过度活化引发,进而影响药物的理想分布和长期疗效。细胞因子的产生是T细胞活化的标志吗?或者,在临床环境中,高水平的细胞因子分泌是TCE疗效的必要条件吗?

这两个问题的答案都是否定的。研究揭示,激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生物功能是由CTL与靶点之间的分子动力学决定的,存在一个阈值实现完全激活。

开创性的研究结果表明,T细胞杀伤并不需要形成稳定成熟的免疫突触,并为下一代TCE的开发提供了将细胞毒性与毒性触发的T细胞刺激解耦的基本原理,在下一代TCE中,CD3结合亲和力被微调(通常是减弱),以达到一个信号的”甜蜜点”,从而在不产生过多细胞因子释放和/或T细胞衰竭的情况下推动抗肿瘤细胞溶解活性。

sweet-spot

迄今为止,许多新型TCE都是基于这一概念进行构建的,所产生的数据都支持“解耦”理论,以下例子候选TCE药物一一进行具体阐述。

TeneoBio (TNB-486)

这款CD19×CD3双特异性抗体是专为治疗B-NHL而设计的。虽然其CD3靶向臂的亲和力较低,降低了体外杀伤力,但却能达到相同水平的最大杀伤,而且刺激细胞因子释放的量明显较少。令人惊奇的是,仅在低剂量下就能在体内长期杀死肿瘤细胞。CD3低亲和力导致的有利生物分布,或诱导T细胞衰竭或活化诱导细胞死亡(AICD)的倾向较少,可能是其改善体内功能的原因。

TNB-486

这种新型TCE代表了一种新型疗法,它能诱导T细胞介导的强大肿瘤细胞毒性,与高水平的细胞因子释放无关,因此是治疗B-NHL的理想候选药物。

Genentech(HER2 TDB 1)

这款与CD3结合亲和力较低的HER2/CD3 TCE可降低全身细胞因子的释放,及对正常组织的脱靶毒性,证明了低亲和力可提高动物模型的总体耐受性,而T细胞结合亲和力对体外和体内抗肿瘤活性的影响有但非常有限。这些数据表明,对CD3和肿瘤靶点的亲和力进行微调是实现CD3 TCEs最大治疗指数的一种有前途的策略。

HER2-TDB-1

Amgen(AMG 424)

这款经过CD3亲和力优化的TCE显示出了杀死癌细胞和引发T细胞增殖的能力,但细胞因子的释放量有所减少,而且有可能在多发性骨髓瘤患者身上激发显著的临床活性。

AMG-424

Regeneron (REGN4018)

这款用于治疗卵巢癌的CD3亲和力定制MUC1×CD3 TCE表明,细胞因子的释放曲线有所减弱,生物分布良好,但其杀瘤效力依然存在,这表明REGN4018具有强大的抗肿瘤活性和良好的耐受性,目前正在进行临床评估。

REGN4018

AbCellera

这家生物技术公司正在通过微调CD3结合亲和力和疾病靶标结合分子,确定抗肿瘤效力和毒性(主要是CRRS)平衡的TCE。其概念验证TCE已显示出高效力和低细胞因子释放。
德泰生物拥有尖端的单B抗体发现平台,致力于发现靶向细胞溶解效应细胞刺激受体的高质量定制激动抗体(agonistic antibodies),以构建下一代多特异性抗体。

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参考文献
[1]Faroudi, Mustapha, et al. “Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell interaction: manifestation of a dual activation threshold.” Proceedings of the National Academy of Sciences 100.24 (2003): 14145-14150.
[2]Riquelme, Erick, et al. “The duration of TCR/pMHC interactions regulates CTL effector function and tumor‐killing capacity.” European journal of immunology 39.8 (2009): 2259-2269.
[3]Malik-Chaudhry, Harbani K., et al. “TNB-486 induces potent tumor cell cytotoxicity coupled with low cytokine release in preclinical models of B-NHL.” MAbs. Vol. 13. No. 1. Taylor & Francis, 2021.
[4]Staflin, Karin, et al. “Target arm affinities determine preclinical efficacy and safety of anti-HER2/CD3 bispecific antibody.” JCI insight 5.7 (2020).
[5]Zuch de Zafra, Christina L., et al. “Targeting multiple myeloma with AMG 424, a novel anti-CD38/CD3 bispecific T-cell–recruiting antibody optimized for cytotoxicity and cytokine release.” Clinical Cancer Research 25.13 (2019): 3921-3933.
[6]Crawford, Alison, et al. “A Mucin 16 bispecific T cell–engaging antibody for the treatment of ovarian cancer.” Science translational medicine 11.497 (2019): eaau7534.

治疗性抗体药物开发中IgG亚型选择

目前,治疗性抗体在治疗癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎症、感染性疾病等领域取得了重大进展,抗体工程的发展进一步推动新型抗体的产生。截至2022年年底已上市的治疗性抗体药物及其衍生物超过100种。基于实用性和功能上的考虑,现在临床上使用的治疗性抗体大多为IgG类型。

在开发治疗性抗体时,IgG亚型的选择是基于其体外活性可以推断体内活性的假设。亚型是决定治疗性抗体的体内生物学活性的关键因素之一。除亚型外,IgG-Fc糖型、抗原决定簇密度、细胞Fc受体多态性等多个参数也共同影响着治疗性抗体体内功能结果,导致准确预测治疗性抗体的体内活性仍有困难。因此在抗体药物设计中应把亚型的结构特征与目的效应功能的关联、体外IgG-Fc和效应配体之间相互作用的分子机制、亚基的生物学活性、理化性质等纳入综合考虑,以确保最大的疗效和安全性。

虽然IgG各亚型在体外实验评估中呈现特定的效应功能,然而在不同疾病中各亚型体内的作用方式可能有所不同。因此,在治疗性抗体的开发中为达到期望的治疗效果并且避免不良反应,选择适宜的抗体亚型就显得格外重要。

IgG亚型结构特征

IgG可根据其在血清中的分布丰度进一步分为IgG1(60%)、IgG2(25%)、IgG3(10%)、IgG4(5%)4种亚型,它们的恒定区序列高度同源。4种IgG亚型其恒定区的CH2区不同、铰链区的核心CXXC序列组成不同,重链和轻链之间的二硫键连接方式也不同。

IgG亚型及其异构体示意图

图1 IgG亚型及其异构体示意图

(A)不同的IgG亚型重链和轻链结构、铰链的长度以及连接两条重链的二硫键的数量。
(B)显示了IgG2的B/B形式(重链间只有两个二硫键,并存在重轻链间的替代连接)以及中间A/B形式。
(C)IgG4的异构体导致半分子交换。

表1 IgG各亚型的结构差异

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
分子质量(kDa) 146 146 170 146
活性形式 二价单体 四价二聚体 二价单体 单价半抗体
同型 4 1 13 0
铰链区氨基酸个数 15 12 62a 12
铰链区链内二硫键的个数 2 4b 11a 2

a:Depends on allotype;b:A/A isomer.

IgG亚型效应功能

人类Fcγ受体家族包括六个成员,它们在细胞分布、与Fc的结合亲和力以及产生的生物活性方面有所不同。功能上最相关的FcγR是FcγRI,FcγRIIA,FcγRIIB和FcγRIIIA。FcγRI是一种对IgG具有高亲和力的激活受体,可以被单体IgG激活。除了FcγRI外,所有其他FcγR只有在抗体与特定抗原结合时,其Fc区才能激活下游效应功能。FcγRIIB是唯一的抑制性FcγR,在许多免疫细胞上表达,包括B细胞,单核细胞,巨噬细胞,DC和肥大细胞。当IgG与抗原结合时,FcγRIIB通过胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)转导抑制信号,抑制ADCC和ADCP。最典型的激活FcγR是FcγRIIA和FcγRIIIA。FcγRIIA主要在单核细胞和巨噬细胞上表达,而FcγRIIIA主要在NK细胞上表达。两种激活的FcγR都有两种等位基因变体。

与结构相适应,4种IgG亚型与抗原结合、免疫复合物的形成、补体激活、触发效应细胞、半衰期和胎盘转运特性均具有特异性。表2总结了IgG亚型功能特征的差异。

在4个IgG亚型中,IgG3与大多种类的FcγR的亲和力结合度最高,但由于其长铰链区和多态性,这两者都增加了稳定性和免疫原性的风险,未能成为治疗性抗体的常规选择。在其余亚型中,IgG1对所有FcγR表现出最高的亲和力,并且可以有效激活ADCC和ADCP反应。IgG4仅对FcγRI具有高亲和力,对其他受体的亲和力较弱,其Fc介导的效应功能较弱。IgG2对FcγRIIAH131形式具有高亲和力,但对FcγRI和其他FcγR没有可测量的或微弱的亲和力。

表2 IgG各亚型的功能差异

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
体内生物学活性 蛋白质抗原 糖类抗原 蛋白质抗原 响应慢性刺激、抗炎活性
半衰期(天) 21 21 7~21a 21
胎盘转运 ++++ ++ ++/++++a +++
与下列物质的抗体反应
蛋白质 ++ +/- ++ ++e
多糖 + +++ +/- +/-
过敏源 + (-) (-) ++
补体激活
结合C1q ++ + +++
Fc受体
FcgRI +++ 65d +++ 61 ++ 34
FcγRIIaH131 +++ 5.2 ++ 0.45 ++++ 0.89 ++ 0.17
FcγRIIaR131 +++ 3.5 + 0.10 ++++ 0.91 ++ 0.21
FcγRIIb/c + 0.12 0.02 ++ 0.17 + 0.20
FcγRIIIaF158 ++ 1.2 0.03 ++++ 7.7 0.20
FcγRIIIaV158 +++ 2.0 + 0.07 ++++ 9.8 ++ 0.25
FcγRIIIb +++ 0.2 ++++ 1.1
FcRn (at pH < 6.5) +++ +++ ++/+++a +++

a:Depends on allotype;b:A/A isomer;c:Multivalent binding to transfected cells;
d:Association constant (×106 M-1) for monovalent binding; e:After repeated encounters with protein antigens, often allergens

靶向肿瘤细胞治疗性IgG亚型的选择

多达12个在肿瘤细胞上表达的靶标已经过临床验证。除靶向EGFR的西妥昔单抗和帕尼单抗分别选择IgG1和IgG2亚型外,所有其他靶标均选择了IgG1亚型。Her2和EGFR属于酪氨酸激酶受体家族,靶向抗体可能通过阻断生长信号发挥抗肿瘤活性,除此之外IgG1抗体诱导的针对受体酪氨酸激酶(RTK)的ADCC和/或ADCP也起着重要的治疗作用。因此,在开发靶向肿瘤细胞上靶标的治疗性抗体时,主要考虑IgG1,它对激活FcγR具有最佳的结合亲和力,可以引起针对肿瘤细胞的强ADCC和/或ADCP活性。此外,当ADCP被激活时,效应细胞(巨噬细胞或树突状细胞)可能会将处理后的肿瘤抗原呈递给T细胞,从而进一步引发持久的肿瘤特异性适应性免疫。

一些肿瘤细胞靶标是免疫检查点(ICP)的配体,例如PD-L1和CD47,它们分别是PD-1和SIRPα的配体。PD-1及其配体PD-L1通过逃避肿瘤中和免疫监视在肿瘤进展和存活中起至关重要的作用。PD-L1在肿瘤细胞和抗原呈递细胞中表达,与T细胞PD-1的结合导致肿瘤中的T细胞功能障碍、衰竭、中和和IL-10产生。因此,阻断PD-1或PD-L1识别过程可以阻断抑制信号传导,从而重新激活效应T细胞杀死肿瘤细胞。简单地阻断PD-L1可以诱导显著的治疗效果,但以IgG1形式保留Fc效应器功能将进一步提高治疗效果。据报道,阿维鲁单抗是一种IgG1亚型抗PD-L1抑制剂,可触发NK细胞介导的细胞毒性和细胞因子产生以对抗三阴性乳腺癌细胞。

ADCC的诱导取决于肿瘤细胞上靶标表达的丰度,每个细胞的最低需求为105~106。与肿瘤组织相比,正常组织通常表达水平要低得多。丰度小于105的细胞诱发可能小,因此不会受到ADCC的损害。

靶向免疫细胞治疗性IgG亚型的选择

靶向免疫细胞靶标的IgG亚型选择更为复杂。由于细胞表达免疫抑制受体的分布不同,如PD-1、TIM-3和LAG-3主要在CD8 T淋巴细胞(免疫效应细胞)中表达,而CTLA-4主要在Treg细胞(免疫抑制细胞)中表达,在开发针对免疫抑制受体(ICP)的治疗性抗体时,应仔细考虑IgG亚型的影响。目前批准的所有PD-1抗体都是IgG4亚型形式,可见IgG4是PD-1抗体的首选形式。这是因为IgG4仅对FcγRI具有高亲和力,但对所有其他FcγR的亲和力较弱,不具有可检测的Fc介导的效应功能,这意味着CD8 T淋巴细胞不会被相应消除。

针对Tregs或其他免疫抑制细胞表达的ICP可以选择IgG1亚型抗体,这些细胞可以通过ADCC/ADCP被抗体清除。靶向CTLA-4的伊匹木单抗就是一种主要通过ADCC/ADCP消除TME中的Tregs细胞来发挥治疗效果的IgG1亚型抗体。而靶向CTLA-4的IgG2亚型替西木单抗自2006年以来一直在进行广泛的临床试验。由于IgG2仅对FcγRIIaH131具有高亲和力,FcγRIIaH131主要在巨噬细胞中表达,在没有CD47-SIRPα阻断剂的情况下不会完全激活,因此替西木单抗将无法从TME中消除Tregs细胞。

免疫刺激受体大多数属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族(如4-1BB,CD40,OX40,CD27,GITR),经激动抗体结合后可刺激免疫。针对ICP受体的抗体单纯阻断靶点可激活T细胞,而通过抗体激活TNFR超家族成员需要抗体与FcγR交联。这表明FcγRIIB是靶向TNFR超家族成员免疫刺激受体的抗体所需要的。此外,CH1结构域中的铰链区也很重要,是抗体激动功能所必需的。给定IgG的铰链越硬,免疫刺激受体在细胞膜上的聚集越稳定,抗肿瘤功效越好。

总的来说,在开发靶向肿瘤抗原的抗体药物时,应优先考虑IgG1亚型,特别是当Fc介导的效应功能是肿瘤治疗的主要作用方式时。在选择免疫细胞中靶标的IgG亚型时,应仔细考虑靶标的性质。如果ICP在免疫效应细胞上表达,则应优先考虑IgG4。如果在Treg或其他免疫抑制细胞上表达,则应选择IgG1。对于具有免疫刺激功能的靶标,特别是TNFR超家族成员的靶标,除了表位筛选外,还应设计增强FcγRIIB参与。

参考文献
[1]Vidarsson G, Dekkers G, Rispens T. IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions. Front Immunol, 2014, 5 (520) : 1–17.
[2]吕若芸,陈忱,魏敬双. 治疗性抗体药物开发中IgG亚型选择[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(7): 104-111.
[3]Yu J, Song Y, Tian W. How to select IgG subclasses in developing anti-tumor therapeutic antibodies. J Hematol Oncol, 2020, 13: 45.

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单个B细胞技术

  • 29天100株抗体
  • 重轻链天然配对
  • 保留抗体多样性

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杂交瘤技术

  • 3000株杂交瘤开发经验
  • 重轻链天然配对

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  • 无物种限制
  • 免疫库库容可达108

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德泰生物基于单个B细胞抗体开发技术,自主研发了SingleB®单B细胞快速单抗发现平台。平台支持小鼠、大鼠、兔、羊驼、人源化小鼠、犬、羊、鸡等多物种抗体发现,通过高通量筛选获得抗原特异性记忆B细胞或浆细胞,单细胞PCR扩增及Sanger测序获取抗体基因序列,并进行重组表达与验证。平台可将抗体发现过程中的binding/blocking功能筛选前置,更快锁定阳性克隆,从动物免疫到获得单抗,快至29天,节省研发时间和费用。

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利用杂交瘤制备单克隆抗体通常操作流程为:抗原制备、用抗原免疫动物、取免疫动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞、对杂交瘤细胞进行筛选及克隆化、利用筛选得到的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的大量生产。了解杂交瘤制备单克隆抗体的详细流程

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技术 优势 劣势
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3.无需培养B细胞
4.保留抗体多样性
技术门槛高
杂交瘤技术 抗体重轻链天然配对 1.许多物种没有可用的融合伴侣细胞
2.细胞融合效率低
3.抗体制备所需时间久
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1.抗体重轻链非天然配对
2.建库较为困难

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哺乳动物细胞蛋白表达

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IgA抗体的治疗性应用

免疫球蛋白A(IgA)是黏膜免疫系统中最主要的抗体成分,也是人体每天产生最多的抗体。与其他免疫球蛋白相比,IgA在分子形式、糖基化模式以及存在1个以上的受体等方面具有独特的性质。

在人体中,IgA单体以两个密切相关的亚型存在,即IgA1和IgA2,区别在于IgA1分子铰链区中多13个额外的氨基酸。这种延伸的铰链区有利于较远距离抗原的识别。两个IgA亚型在其CH1和CH2结构域中都存在高度N-糖基化,糖类约占其含量的6%。IgA1在铰链区含有额外的O-连接聚糖,由N-乙酰半乳糖胺与半乳糖和唾液酸组成。值得注意的是,IgA1铰链区的聚糖组成是异质性的,据报道异常糖基化与IgA肾病的发病机制有关。

IgA主要以三种不同的形式存在。在人体血清中以单体形式存在,而在粘膜部位,它以聚体的形式存在(pIgA),可分为二聚体IgA(dIgA)和分泌型IgA(sIgA)。

相关阅读:免疫球蛋白A(IgA)结构、分类及功能介绍

IgA-structure

IgA作为治疗性抗体的优势

除少数例外,几乎所有治疗用的抗体均为IgG类,这可以归因于该抗体类别在人体内的天然丰度,长半衰期,但也归因于对IgG的全面了解和对其他同种型了解有限。

IgA作为治疗性抗体主要具有以下优势:与其他免疫球蛋白同种型相比,IgA可以与多种受体相互作用,包括多聚免疫球蛋白受体(pIgR)、转铁蛋白受体(CD71)、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、dectin-1、DC-SIGN和FcαRⅠ(CD89)等,能更有效地激活细胞效应功能。以癌症研究背景为例,IgA可以通过FcαRⅠ诱导比IgG更强的中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤力,相比之下IgG缺乏中性粒细胞的有效活化。这可能是由于IgA介导的LTB4释放导致中性粒细胞迁移增强。此外,IgA通过ADCC、氧化爆发(oxidative burst)、细胞因子和中性粒细胞的NETs释放诱导更强的吞噬作用。尽管FcαRⅠ表达低于FcγR,但IgA-FcαRⅠ结合诱导比IgG-FcγR结合更强的ITAM信号传导。

FcαRⅠ-FcR-IgA-interaction

与IgG相比,IgA除了通过FcαRⅠ ITAM信号通路介导更强的免疫激活外,IgA还可以通过抑制性ITAMi途径介导更强的免疫调节作用。这些免疫调节特性在治疗炎症性疾病中具有很大的治疗潜力。

IgA作为治疗性抗体待解决的问题

IgA的研究和临床使用可能由于以下几个原因受到阻碍:(1)小动物模型的问题,尤其是啮齿动物。啮齿动物与人类IgA有很大不同,小鼠和大鼠B细胞仅产生一个亚型的IgA,且其在血清中是以二聚体形式存在。存在两个亚型IgA这一特征仅与黑猩猩、大猩猩和长臂猿共享。主要的IgA受体FcαRⅠ在啮齿动物中缺失,并且人IgA在小鼠中只有很短的半衰期。(2)重组生产IgA的问题。由于IgA存在高度和异质的糖基化,生产过程中可能引起糖基化类型的改变,增强免疫原性和清除率。(3)与IgG相比,IgA半衰期短,需要较短的给药间隔。

IgA的治疗潜力

传染病治疗

多年来,sIgA一直被认为是对抗粘膜表面病原体的第一道屏障。sIgA能凝集细菌,干扰细菌运动,中和细菌毒素,还能抑制细菌对上皮的粘附,从而防止病原体向循环传播。已经证实IgA可对抗多种胃肠道病原体,例如鼠伤寒沙门氏菌,福氏志贺氏菌,艰难梭菌以及某些病毒。特别是,IgA对仙台病毒、人类免疫缺陷病毒和流感病毒具有中和作用。最近研究表明,IgA在中和SARS-CoV-2方面比IgG更有效。IgA还可以通过与FcαRⅠ的相互作用介导对微生物感染的保护。已经证明,在人FcαRⅠ转基因小鼠中输注抗原特异性IgA可以导致结核分枝杆菌或百日咳博德特氏菌的清除率增强。基于这些观察结果,被动转移特异性IgA和主动免疫可能是对抗病毒和细菌感染的有效策略。

IgA的治疗潜力

IgA的治疗潜力

轮状病毒疫苗被视为了解肠道IgA在胃肠道病毒感染中的治疗潜力的模型系统。在该疫苗开发前后,几项相关研究表明,轮状病毒特异性IgA是赋予人类和动物模型长期免疫力的主要效应分子之一。目前的两种口服疫苗Rotarix®(葛兰素史克生物制品)和RotaTeq®(默克)于2006年获准使用。接种两剂疫苗后,血清抗轮状病毒IgA阳转率约为95%,可通过血清IgA滴度预测保护持续时间和疫苗效力。

IgA替代疗法

原发性免疫球蛋白缺乏症(PAD)患者的免疫球蛋白水平降低,易发生感染。使用IgG替代疗法成功地降低了严重细菌感染的频率。然而,非呼吸道和上呼吸道感染持续存在,尤其是IgA和IgM水平低的患者。一项研究报告证实,使用Pentaglobin®(一种含IgA和IgM的制剂)成功治疗PAD患者的空肠弯曲菌复发性感染。与Pentaglobin®相比,Trimodulin(BT-588)的IgA含量其两倍,可限制重度社区获得性肺炎患者的继发感染。

值得注意的是,没有关于选择性IgA缺乏症治疗的报道(选择性IgA缺乏症是最常见的PAD)。这可能是由于对Ig产品的反应和抗IgA抗体的出现。过往曾出现缺乏IgA的患者由于输注IgG(含有少量IgA)而出现抗IgA抗体,导致全身性过敏反应。但也有综述详细描述了抗IgA抗体的产生与过敏反应的发生并不相关。未来,需要大型研究来评估含有IgA的产品在预防感染方面的安全性和治疗效果,特别是在选择性IgA缺乏症的治疗中。

抗肿瘤治疗

用于治疗各种癌症的治疗性抗体通过直接和间接效应功能的组合来消除肿瘤细胞,包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。虽然IgG抗体在治疗领域占主导地位,但应该注意的是,IgA通过表达FcαRⅠ的巨噬细胞和中性粒细胞的活性也可以有效杀死肿瘤细胞。在这方面,体外实验结果表明,与IgG相比,IgA在中性粒细胞触发ADCC方面更胜一筹。随着FcαRⅠ转基因小鼠的产生,体内实验模型得到了极大的改善。在各种实体瘤模型中,已经证明抗EGFR IgA2抗体具有有效的抗肿瘤活性。在小鼠淋巴瘤模型中,抗CD20 IgA2在中性粒细胞募集到肿瘤部位后引起强大的抗肿瘤作用。

IgA抗体的半衰期很短,到目前为止阻碍了它们作为治疗性抗体的使用。最近的糖工程策略显著改善了重组IgA的药代动力学特性。例如,与野生型IgA相比,唾液酸化增加和聚糖末端半乳糖残基缺失的IgA分子表现出更长的血清半衰期,为免疫治疗提供了一种有希望的形式。另一种策略通过与可以结合白蛋白的结构域融合来增加IgA的半衰期。在人体中,可延长其血清半衰期至19天。除药代动力学外,IgA和CD47-SIRPα阻断剂的联用也提供了证据,表明靶向吞噬检查点抑制剂可增强IgA功能,这与IgG一致。

炎症性疾病治疗

IgA与FcαRⅠ结合传播抑制信号,导致抗炎反应。因此,靶向FcαRⅠ可能是治疗各种炎症性疾病的一种有希望的策略。事实上,发现向FcαRⅠ转基因小鼠施用mIgA可预防和解决实验诱导的关节炎。同样,在类风湿关节炎患者中,mIgA能够在体外抑制促炎细胞因子的产生和骨髓细胞的趋化性。抗FcαRⅠ Fab片段可以驱动ITAMi诱导的抑制信号传导,并已在肾脏炎症模型中证明了其治疗潜力。还有研究表明,用抗FcαRⅠ预处理FcαRⅠ转基因小鼠可大大减少支气管炎症的发展。综上所述,FcαRⅠ靶向可能是预防或治疗炎症性疾病的一种新的有前途的工具。

小结

在IgA半衰期和生产方面的研究进展为进一步拓展商业规模IgA生产提供了有意义的改善。由于IgA是对抗粘膜表面病原体的主要抗体,最近的研究还针对口服IgA进行了开发。全长sIgA或嵌合IgA已经被添加到食品中,用于在体外中和细菌毒素或预防胃肠道感染。未来的工作还应集中在简化制造工艺,降低生产成本上,也可汇集IgA和IgG同种型的优势,考虑将交叉同种型分子或双特异性抗体的工程设计用于治疗应用。

参考文献
[1]Sterlin D, Gorochov G. When Therapeutic IgA Antibodies Might Come of Age. Pharmacology. 2021;106(1-2):9-19. doi: 10.1159/000510251.
[2]Bohländer F. A new hope? Possibilities of therapeutic IgA antibodies in the treatment of inflammatory lung diseases. Front Immunol. 2023 Mar 27;14:1127339. doi: 10.3389/fimmu.2023.1127339.
[3]Breedveld A, van Egmond M. IgA and FcαRⅠ: Pathological Roles and Therapeutic Opportunities. Front Immunol. 2019 Mar 22;10:553. doi: 10.3389/fimmu.2019.00553.

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T细胞衔接器(TCE)作用机制与技术平台

细胞毒性T细胞是癌症患者治疗过程中效力最高的免疫细胞群。1992年,重组IL-2(一种T细胞活化细胞因子)获得批准,以及T细胞检查点抑制剂(如PD-1拮抗抗体帕博利珠单抗和纳武利尤单抗)的临床影响,获得了T细胞在癌症治疗中重要性的早期临床证据。更直接的证据来自自体肿瘤浸润T细胞(TILs)的治疗方法,该疗法与清淋治疗和IL-2相结合,在黑色素瘤和卵巢癌患者中产生了强烈的反应。当自体T细胞被改造为表达重组嵌合抗原受体(CAR)时,只要它们能够对细胞表面抗原进行主要组织相容性复合体(MHC)非依赖性识别,就可以在液体肿瘤中观察到高完全缓解率和持久反应,已有几种靶向CD3或BCMA的CAR-T疗法获得批准。尽管细胞疗法在非实体瘤中获得临床成功,但该治疗可能具有显著毒性,且在实体瘤中的活性有限。

T细胞衔接器(TCE)与作用机制

T细胞衔接器(T cell engager, TCE)是细胞因子、检查点抑制剂和T细胞疗法的替代疗法,它们通常基于抗体或抗体片段,能够将体内任何T细胞与表达选定表面标志物的细胞连接起来。TCE可以精确控制剂量和摄入时间,有助于最大限度地减少副作用,并且生产过程比细胞疗法要简单得多。靶向CD19、CD20、BCMA的TCE在复发/难治性(r/r)急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)已经观察到令人信服的完全缓解率。

TCE一个臂靶向肿瘤相关细胞表面抗原(TAA),另一个臂靶向TCR-CD3复合物中CD3ε亚基,结合癌症细胞和T细胞。这种结合促进T细胞和癌细胞之间免疫突触的形成,T细胞可以通过突触将穿孔素和颗粒酶注入到附着的癌细胞中。突触的形成引起TCR交联和T细胞活化,引发促炎细胞因子的释放,诱导T细胞增殖。从理论上讲,每种细胞毒性T细胞表型都可以通过这种方式结合并参与连续癌细胞裂解,包括CD8+T细胞,CD4+T细胞,γ/δT细胞和NKT细胞。通过识别细胞表面抗原,TCE使得T细胞的活化摆脱了MHC分子、抗原肽加工和呈递以及TCR特异性的限制。

TCE-mechanism

TCE技术平台

IgG-like TCE

  • Mosunetuzumab(Genentech, Inc.)

    Mosunetuzumab采用knobs-into-holes技术进行重链配对,采用体外退火技术进行重轻链配对,已被批准用于治疗R/R滤泡性淋巴瘤(FL)。

    Mosunetuzumab

  • Teclistamab(JNJ)

    Teclistamab是一种基于Genmab公司开发DuoBody®平台的TCE,靶向BCMA/CD3,已上市用于治疗r/r多发性骨髓瘤(MM)。

    DuoBody®平台利用限制性Fab臂交换技术(controlled Fab-arm exchange, cFAE),在两个IgG抗体的CH3区域分别引入K409R和F405L突变,利用哺乳动物细胞表达系统进行单独的重组表达与纯化,随后将两种抗体在定制条件下利用cFAE重新组合,即可高效组装获得具有正常IgG结构的双特异性抗体。Teclistamab抗体骨架为IgG4亚型,需要对其进行PAA突变(S228P L234A/L235A)除去IgG4的天然FAE过程和Fc的相关响应功能(ADCC,CDC)。

    Teclistamab

  • Epcoritamab(AbbVie & Genmab)

    Epcoritamab也基于DuoBody®平台,最近被批准用于治疗R/R弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

  • ERY974(Chugai)

    ERY974是一种靶向Glypican-3(GPC3)的TCE,用于治疗实体瘤,目前处于临床前开发阶段。它的构建是通过在CH3结构域引入静电转向突变来驱动重链的异源二聚化,同时利用共同轻链来避免轻链的错配(ART-Ig)。

  • REGN1979(Regeneron)

    REGN1979为靶向CD20/CD3的TCE,该TCE使用共同轻链,并在重链CH3区域中引入突变,形成IgG1/IgG2/IgG4与IgG3的局部同型嵌合体,利用蛋白质A的选择性纯化获得双特异性抗体。REGN1979现正在适应症恶性淋巴瘤(B-NHL)的临床试验中。

    REGN1979

这种TCE结构有望成为一种新平台。基于该平台,还有一些用于治疗实体瘤的TCE,包括REGN4018——靶向MUC16/CD3,用于治疗卵巢癌(OC)和REGN4336——靶向PSMA/CD3,用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC),正在临床试验中。

基于抗体片段的TCE

虽然Fc-like TCE具有天然IgG的特性,有利于抗体药物的制备和PK/ADA特性,但或出于独特的医疗目的,或由于生产工艺技术或商业限制,基于抗体片段的TCE也逐渐走入视线。

基于抗体片段的TCE通常是——

  • 由链接的scFvs, scFabs或sVDs等组成的简单结构
  • 缺少半衰期延长(HLE)部分
  • 难以生产,容易聚合/碎片
  • 体积小,半衰期短

这类TCE的代表是Amgen公司基于BiTE®平台,靶向CD19/CD3的Blinatumomab,已被批准用于治疗成人急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)及后续更多的适应症。

为了延长半衰期,减少给药频率,Amgen在BiTE®上融合Fc结构域,产生了一系列HLE BiTE分子(分子量约为106 kD)。AMG757是一种靶向DLL3的HLE BiTEs,目前正在研究用于复发性小细胞肺癌(SCLC)治疗。

以类似的方式,MacroGenics开创了DART平台并以此平台设计了治疗性分子,这些分子将两个独立的fab以异源二聚体结构结合在一起,可根据半衰期长短进行调整,具有或不具有Fc结构域。MGD024是一种用于治疗r/r CD123(+)血液系统恶性肿瘤患者的靶向CD123/CD3的Dart TCE,目前已进入临床研究。

Fragment-based-TCE1

Harpoon公司开发了针对实体瘤和血液系统恶性肿瘤T细胞激活性多功能抗体,抗体基于其创建的TriTAC、ProTriTAC(前药)和TriTAC-XR三个三特异抗体平台,这些TCE平台引入了单域抗体,并通过结合白蛋白来延长半衰期。

TriTAC仅含有一条肽链,包含三个结构域,分别结合CD3,人血清白蛋白和TAA。其中结合CD3表位的抗体为单链抗体(scFv),结合人血清白蛋白和TAA的抗体为纳米抗体。
此外,Immunocore公司开发的第一种也是唯一一种被批准用于实体瘤(黏膜黑色素瘤,mUM)治疗的TCE——Tebentafusp-tebn(KIMMTRAK),由TCRm和靶向CD3的scFv组成。

Fragment-based-TCE2

其他类型的TCE

  • EMB-07/EMB-06

    EMB-07是利用EpimAb的FIT-Ig平台设计的,靶向ROR1/CD3的TCE,用于实体瘤的治疗,目前正在进行临床评估。

    Appended-IgG在常规IgG上附加scFv、Fab或纳米抗体。它们的半衰期与亲代IgG相当。然而,非自然结构可能会增加聚集性、不稳定性和ADA风险。FIT-Ig平台在不引入突变或连接子(linker)的情况下产生双特异性抗体,有利于其制备和稳定性。

    EMB-06是另一种基于FIT-Ig平台的靶向BCMA的TCE,目前也在临床评估中。

  • BA1202

    BA1202为Boan Biotech靶向CEA/CD3的对称三价单链抗体,其具有类似蝴蝶形的抗体结构:Fab端与CEA双价结合,而轻链C端连接的二价单链抗体与CD3单价结合(可能是由于空间构象的改变或亲和力降低),目前已进入临床试验阶段。

  • Cibisatamab (RG7802)

    Cibisatamab是一种靶向CEA/CD3的TCE,通过将第二个与CEA结合的Fab区添加到对称KIH结构来实现与疾病靶点的“低亲和力(affinity)高亲合力(avidity)”结合,试图通过减少脱靶毒性来实现疗效和安全性的平衡。目前该TCE正在临床试验中。

    TCE-Other-Than-Discussed1

  • CX-904

    CX-904是由Cytomx公司为精准靶向设计的前体药物,在肿瘤微环境中通过特异性蛋白水解条件被激活,靶向EGFR/CD3,目前正在临床试验中。

  • Imvotamab (IGM-2323)

    Imvotamab是靶向CD20和CD3的IgM同种型TCE。Imvotamab拥有10个CD20结合域,比IgG同种型的抗体有更高的亲合力,从而能够克服靶点减少引起的耐药,并实现比目前已批准的抗体疗法更好的疗效。该公司更多的IgM TCE药物包括IgM-2644(CD38/CD3)和IgM-2537(CD123/CD3)。

  • TNB-486

    TNB-486是一种由Tenobio公司开发靶向CD19的不对称TCE。它的形式介于IgG-like TCE和基于抗体片段TCE之间。它由一半结合CD3的IgG和一半结合CD19的重链抗体(HcAb)组成,目前正针对r/r B淋巴瘤进行临床评估。

  • YBODY

    与TNB-486格式相似,YZYBio公司的YBODY平台由一半与疾病靶点结合的IgG和一半与CD3结合的scFv组成。一些基于YBODY平台的TCE目前正在临床试验中,如M802(HER2/CD3)。

    TCE-Other-Than-Discussed2

参考文献
[1]Baeuerle PA, Wesche H. T-cell-engaging antibodies for the treatment of solid tumors: challenges and opportunities. Curr Opin Oncol. 2022 Sep 1;34(5):552-558. doi: 10.1097/CCO.0000000000000869.
[2]Pillarisetti K, Powers G, Luistro L, et al.Teclistamab is an active T cell-redirecting bispecific antibody against B-cell maturation antigen for multiple myeloma. Blood Adv. 2020 Sep 22;4(18):4538-4549. doi: 10.1182/bloodadvances.2020002393.
[3]Smith, E., Olson, K., Haber, L. et al. A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B-cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2016). https://doi.org/10.1038/srep17943.

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