伴随诊断（companion diagnostic，CDx）是一种体外诊断技术，能够提供有关患者针对特定治疗药物的治疗反应的信息，有助于确定能够从某一治疗产品中获益的患者群体，从而改善治疗预后并降低保健开支。此外，伴随诊断还有助于确定最有可能针对治疗药物产生响应的患者群体。
为了解哪些病人可以受益于靶向药物治疗，或者哪些病人不能接受靶向药物治疗，FDA（美国食品和药物管理局）与药物和设备制造商将“开发某些测试”，并称之为“伴随诊断”。
伴随诊断市场可细分为肿瘤学、心血管疾病、中枢神经系统、炎症及病毒学。其中，肿瘤学是伴随诊断市场创收最高的疾病领域，目前已开发了多种伴随诊断试剂盒用于各类癌症生物标志物的检测，该细分市场的主要驱动力是靶向性药物研发的增长，需要相应的伴随诊断试剂盒的开发。
图1 CDx与药物研发
目前，FDA已经通过上市数十种伴随诊断试剂盒及相应设备，其中，14个诊断用途的兔单抗相关产品已被批准，涉及非小细胞肺癌、乳腺癌等不同肿瘤类型的伴随诊断。
图2 部分FDA通过CDx名单
HER-2实际上是一种原癌基因的名称，全称叫做人类表皮生长因子受体2，是一种跨膜受体样的蛋白，具有酪氨酸激酶的活性，在临床中检测HER-2基因的表达主要是采用免疫组化和荧光原位杂交的方法，而HER-2的扩增或者不表达，常常是发生在乳腺癌，少数可以发生在胃癌的病人。
PATHWAY anti HER-2/neu (4B5)兔单克隆初级抗体是由罗氏研发的一种兔单克隆抗体，供实验室使用。在BenchMark ULTRA仪器上使用ultraView通用DAB检测试剂盒，通过免疫组织化学（IHC）对福尔马林固定、石蜡包埋的正常和肿瘤性乳腺组织切片进行半定量检测。
PATHWAY anti HER-2/neu(4B5)适用于识别符合赫赛汀®（IHC 3+或IHC 2+/ISH扩增）、KADCYLA®（IHC 3+或IHC 2+/ISH扩增）或ENHERTU®（IHC 1+或IHC 2+/ISH非扩增）治疗的乳腺癌患者。与其他市场上的HER2克隆相比，罗氏HER2(4B5)克隆表现出最稳定的性能和卓越的质量。
图3 PATHWAY anti HER-2/neu(4B5)与其他克隆对比
程序性死亡配体1（PD-L1）是一种跨膜蛋白，通过与它的两个抑制性受体——程序性死亡受体-1（PD-1）和B7.1——结合而下调免疫反应。PD-1是T细胞激活后在T细胞上表达的一种抑制性受体，在慢性刺激状态下，如慢性感染或癌症，PD-1的结合会抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞溶解活性，导致T细胞功能失活或衰竭。中断PD-L1/PD-1通路是一种有效的策略，可以重振被肿瘤微环境中PD-L1表达抑制的肿瘤特异性T细胞免疫。
图4 PD-L1免疫检查点
VENTANA PD-L1 (SP142)试剂是罗氏的一种定性的免疫组化检测试剂，使用兔单克隆抗PD-L1克隆SP142，用于评估下列福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中的PD-L1蛋白，在BenchMark ULTRA仪器上用OptiView DAB IHC检测套件和OptiView扩增套件进行染色。
图5 VENTANA PD-L1(SP142)试剂的辅助诊断适应症
根据治疗设定，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，通过VENTANA PD-L1（SP142）检测法确定的PD-L1表达量TC≥50%或IC≥10%可能与TECENTRIQ（atezolizumab）的总生存率提高有关。
VENTANA PD-L1 (SP263)同样是用于识别符合TECENTRIQ (atezolizumab)治疗的早期NSCLC患者的兔单克隆初级抗体。它是用于检测实验室的福尔马林固定、石蜡包埋组织中的PD-L1蛋白，可作为评估人类组织中PD-L1表达的辅助工具。
图6 罗氏其他伴随诊断
相对IVD领域其他诊断方式，伴随诊断目前仍处于市场发展初期阶段，通过FDA认证的市售产品也相对较少。兔单抗由于其本身灵敏度高，识别表位更精细等优势，更适合作为伴随诊断抗体进行IHC检测使用，帮助患者更好得进行治疗，并降低治疗成本，已成为各大诊断企业的研究方向之一。
参考文献
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纳米抗体（Nanobody, Nb），又称为单域抗体（Single-domain antibodies, sdAbs），是来源于骆驼科动物和鲨鱼的一种独特的抗体，最初由比利时免疫学家Hamers-Casterman于1989年在分离骆驼血清中的抗体时偶然发现。
传统抗体的结构类似于“Y”形，是由两条重链和两条轻链构成的对称结构。一些骆驼科动物等在其生长进化的过程中，自身的免疫系统中出现了缺失轻链及重链CH1结构但完全保留抗原结合活性的重链抗体（HCAb）。HCAb特异性结合抗原的区域为其重链的可变区，即VHH（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody）。VHH经重组表达后，可获得只含有单个结构域的最小单元抗原结合片段，即纳米抗体。
纳米抗体仅有12~14 kDa，其晶体直径为2.5 nm，长4 nm，因此被认为是已知的可以与抗原结合的最小单位。
图1 各类抗体结构示意图
纳米抗体基于重链抗体VHH的特殊结构，集传统抗体与小分子药物的优点于一体，并在诸多方面克服了传统抗体的缺陷，逐渐在生物医药研发与临床体外诊断行业中大放光彩。其优势在于：
1、分子量小。传统抗体分子量约150 kDa，纳米抗体约是其十分之一；不仅如此，纳米抗体具有极强的组织渗透力，可直接穿透血脑屏障，利于对肿瘤的诊断与靶向治疗。
2、免疫原性低。纳米抗体不含Fc段，避免了Fc段引起的免疫反应，且与human VH的同源性较高（67%~87%），与人的生物相容性较好。
3、特异性强，抗原亲和力高。由于重链可变区是抗原主要结合区域，并且VHH的CDR3区更长，氨基酸残基数是传统VH的2~3倍，这样的结构特性，可以形成指状凸环并嵌入抗原分子沟槽或裂隙内，进一步识别抗原表面的孔洞或隐藏的表位；不仅如此，VHH的CDR3可以和CDR1甚至FR2间多形成一条二硫键用于稳定结构，可以最大程度优化结合位点的拓扑结构，并且促进CDR3朝向抗原的方向。因此，天然重链抗体及其进一步重组得到的纳米抗体具有更强的抗原结合能力。
4、适用于原核表达和各种真核表达系统，大规模生产成本低、周期短。纳米抗体具有亲水性和单多肽性，且缺乏糖基化修饰，可在原核表达系统中进行重组生产，具有相当的成本效益。同时，纳米抗体不易丧失生物活性，易于储存。
5、高亲水性。普通单域抗体轻重链断开后，VH表面的氨基酸疏水残基因大量暴露会相互粘附甚至聚集成块。而在纳米抗体中，FR2上的疏水性氨基酸Val37、Gly44、Leu45、Trp47突变为亲水性的Phe/Tyr37、Glu/Gln44、Arg/Cys45、Gly/Phe/Ser/Leu47，水溶性增加，抗体聚合因此减少。
6、高稳定性、高耐性。纳米抗体的高稳定性来源于其内部的多个二硫键，可耐受高温、强酸、强碱等致变性条件，在90℃处理后仍能复性并重新获得生物活性。
纳米抗体虽有具有较多优势但仍然存在着一定的局限性。传统抗体主要从可人工饲养的实验小鼠中获得。相比之下，纳米抗体的开发原料则多依赖从羊驼等骆驼科动物中进行提取。因此，大规模开发纳米抗体需要大规模的畜牧业或者动物饲养机构给予支持，且需选择健康良好、体型适中的动物，这是相对困难的。
此外，纳米抗体作为治疗性药物时，由于其体积小，因此肾脏清除快，半衰期短，有时需要通过一些方法来延长其半衰期。
羊驼体内血清抗体主要包括IgG1，IgG2和IgG3三种亚型，其中IgG1与传统抗体结构相似，含有2条重链和2条轻链；IgG2和IgG3是缺少CH1和轻链结构域的重链抗体。
自上世纪九十年代被报道至今，纳米抗体基于其优越的特性如分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、免疫原性弱、生产成本低等，已经成为了抗体工程研究最前沿的技术之一，被广泛应用于生物学和医学等领域，具有广阔的应用前景。
参考文献
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纳米抗体自被发现以来，已经被广泛用于生物药研发、临床体外诊断、肿瘤学及免疫学研究等众多医学领域。纳米抗体不仅有体内成像的潜在作用，其在作为治疗肺部疾病、全身性红斑狼疮等方面的生物药物研发上也有很大的发展。
纳米抗体可以在肿瘤组织中有效渗透，可作为很好的示踪剂，通过检测或定义生物标志物来辅助癌症的早期诊断和预防。相较其他基于单克隆抗体的诊断技术，纳米抗体在极端温度、pH值或离子强度下的高稳定性，确保了其在恶劣条件下的应用。此外，纳米抗体的检测灵敏度更高，检测结果更精确。
产生针对（未知）癌症生物标志物的纳米抗体的一个巧妙而快速的策略是通过对病人样本进行免疫接种，通过这种方法研究人员识别了一种新的乳腺癌特异性生物标志物——细胞角蛋白19（CYFRA21-1）。同样，基于纳米体的反向蛋白质组学技术被用于多形性胶质母细胞瘤（GBM）的诊断与治疗。通过对纳米抗体-抗原的结合对进行质谱分析，可以发现新的GBM生物标志物TRIM28和β-肌动蛋白。
纳米抗体的分子量小，能够穿过人血脑屏障向脑中转移，可以介导药物、多肽等大分子物质，从而起到治疗的作用。
纳米抗体不受还原性细胞质环境的影响，可以作为体内抗体使用。一方面来说，有些类型的纳米抗体有助于实现高分辨率的蛋白分析，更好地理解蛋白质结构和功能之间的关系。例如，一种可以抑制肌成束蛋白介导捆绑肌动蛋白的纳米抗体表明，肌成束蛋白的捆绑活动是癌细胞内生期所必需的；一种针对肌动蛋白分支调节器皮动蛋白SH3结构域的纳米抗体表明，皮动蛋白的SH3结构域功能是内生期形成和活性的基础。同样地，有一种纳米抗体可以通过阻止CapG覆盖肌动蛋白聚合物的(+)端而改变肌动蛋白丝的长度这一行为，来削弱体外入侵。这三个例子都表明，纳米抗体可以通过实现高分辨率的蛋白分析，来帮助通过药物化学发现或合理设计来获得新的治疗药物。不仅如此，对于一个过度表达的蛋白质，在分子研究中将其从细胞中提取出来相对容易实现，但对于常驻的内源性蛋白来说，则不太容易实现。然而，研究人员用靶向序列标记纳米抗体可以使它和内源性抗原转移到细胞内的任何区间或区域，并通过示踪解释蛋白位置和功能之间的相关性，即使该纳米抗体与抗原特异性结合无法阻断蛋白功能。
另一方面，从治疗的角度看，有一种针对CapG（一种相对未知的细胞骨架蛋白）的纳米抗体在正位的体内异种移植模型中大幅遏制了乳腺癌的转移。它表明，除了GPCRs或激酶/磷酸酶之外，还存在许多药物靶点，通过抑制这些靶点可以削弱癌细胞的转移作用，纳米抗体的应用前景是一片光明的。
纳米抗体分子量小，针对肿瘤特异性受体的纳米抗体可作为输送毒素或药物到肿瘤的载体，从而减少对正常细胞的非特异性毒性并减少副作用。缺乏Fc尾端的纳米抗体在介导药物运输到肿瘤细胞受体时，也不会引发Fc相关的免疫原性反应。纳米颗粒药物一般使用的载体包括脂质体、胶束、基于白蛋白的纳米颗粒（NANAPs）和基于聚合物的聚合体或多聚物，其应用广泛，作用显著。例如，在纳米抗体EGa1抗生长因子EGFR的过程中，研究员Van der Meel和他的同事们将抗EGFR的纳米抗体连接到脂质体的表面上，这与受体介导的EGFR内化相吻合，从而使EGFR含量降低。此外，在脂质体上加载抗IGF-1R激酶抑制剂AG538，还可以影响IGF-1R的信号传导，并进一步增加了对体外癌细胞生长的抑制作用。Talleli等人将同样的纳米抗体应用于热敏性、可生物降解的聚合物胶束的表面，不仅可抑制肿瘤的胶束，还能通过共价包封化疗药物阿霉素来进一步提高其作用。另一方面，由于蛋白质在血清中含量丰富，基于白蛋白的纳米颗粒（NANAPs）的生物相容性和安全性更高。将多激酶抑制剂17,864包裹在EGa1涂层的NANAPs中，可以通过胞吞作用使得溶酶体消化NANAPs颗粒，使得抑制剂在细胞质溶液中被释放，抑制癌细胞的增殖。不仅如此，近几年纳米抗体介导的人工聚合体以及由PEG化的PEI共轭物组成并以抗MUC1纳米抗体修饰的多聚物的靶向治疗也受到颇多关注。
纳米抗体靶向性放射核素疗法是治疗癌症最广泛的一种方式，带放射性标记的VHH识别和结合原发肿瘤部位与病变组织，直接提高放射核素靶向肿瘤的辐射剂量，可大幅降低对周围正常组织的影响与伤害。治疗癌症的另一种方式是光动力疗法，该疗法产生的副作用较小，它是通过将光敏剂与纳米抗体结合靶向肿瘤组织，通过激活光敏剂引发光化学反应产生细胞毒性作用，杀死肿瘤细胞，进行精确有效的治疗。
在分子成像领域，小分子量的纳米抗体是非常有优势的。它能使肿瘤快速聚集，并均匀分布，且能快速地在血液中清除，有助于提高肿瘤与背景的比率。此外，纳米抗体可以很容易地与几种成像剂结合并具备相对安全的高特异性。
纳米抗体在分子影像中主要用于肿瘤的特异性显像、动脉粥样硬化斑块的探测、疗效评估及个体化治疗等方面。对癌症进行可视化判断的主要方式包括单光子发射计算机断层成像技术（SPECT）、正电子发射断层扫描（PET）、超声波成像及光学肿瘤成像。
纳米抗体基于γ-射线，与放射性核素如99mTc、177Lu、123I和111In相连用于SPECT成像，与正电子发射的放射性同位素68Ga、124I或89Zr相连可用于PET成像，与近红外荧光团（如IRDye800CW）共轭，以进行光学肿瘤成像。选择主导成分进行（预）临床测试通常基于产量、亲和力和特异性，并应始终以其（放射性核素）标记的形式重新评估。当在细胞系模型中的内化作用被确定后，在体内进行最终验证，包括肿瘤摄取率、肿瘤与正常器官的比例和快速血液清除等。因此，选定的部分能够在注射后1小时内进行成像，有助于提高病人的安全性。在标记抗体用于小鼠等动物实验时，光学成像和超声成像技术操作更简便，在使用光学成像时纳米抗体给药后2小时就可以划定肿瘤边缘。
最后，在研究被标记的纳米抗体与肿瘤治疗过程中的负荷相关性时，分子影像可以直观检测疾病治疗中分子水平的变化，有利于肿瘤的疗效评估有利于后续治疗。
纳米抗体不仅适用于肿瘤疾病的诊断和治疗，对于一些病毒、细菌、寄生虫与毒素等感染性疾病，纳米抗体也具有相当的潜在优势。与传统抗体无法抵御已经侵入宿主细胞内的病毒不同，纳米抗体不仅能在早期阶段拮抗病毒，而且还可以被设计为胞内抗体来抑制病毒的复制、组装及释放。纳米抗体的研发也能应用于主要使用抗生素治疗的细菌感染，可一定程度避免抗生素耐药性的相关问题。
对于寄生虫与真菌来说，目前纳米抗体主要聚焦于非洲锥虫病，即睡眠病的治疗。得益于纳米抗体的低分子量和高亲和力的特点，纳米抗体能够结合锥虫表膜上变异糖蛋白隐蔽的保守抗原表位，从而干扰锥虫的内吞作用，表现出直接溶解锥虫的作用。
由于纳米抗体有抗真菌的作用，其在去屑洗发水中的应用也颇为广泛。除此以外，抗体药物用于拮抗动物毒素如蛇毒毒素、细菌毒素等方面也已经得到了应用并在不断拓展。
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