抗体药物成药性分析

近年来，抗体药物凭借其高靶向特异性、低免疫原性和长效药代动力学特性，在多种疾病治疗领域获得广泛应用，获批上市数量显著增加。得益于现代生物技术的进步，抗体发现平台日益成熟，具备特定功能的生物大分子持续涌现。然而，抗体药物研发仍面临较高的失败率，导致最终获批药物有限。其核心挑战在于分子固有的易聚集性、稳定性不足和溶解性差等特性，这些缺陷为后续的生产工艺、制剂开发、储运环节带来显著困难，阻碍了药物成功开发。因此，在早期分子筛选中，亟需运用体外方法评估分子的均一性、稳定性、溶解度和结合特异性，筛选出优势候选分子，并识别其潜在风险。这一过程——成药性评价——旨在降低因分子自身不良属性导致的后期研发失败风险。

成药性评价主要通过一系列高通量的技术手段，对抗体的一级结构、翻译后修饰、聚体和片段、电荷异质性、疏水性、构象稳定性、胶体稳定性、溶解度、黏度、蛋白质-蛋白质相互作用、非特异性相互作用、表位竞争和亲和力等方面进行多维度的分析，筛选出最佳的候选分子，确保在后续的开发中具有较为稳定的性质，从源头上保证产品的质量。

传统上，抗体药物发现阶段的筛选过程被认为是漏斗型筛选，通过杂交瘤技术、展示技术（噬菌体展示、细胞表面展示、无细胞分子展示技术）、人源抗体转基因小鼠和人杂交瘤技术、展示技术（单B细胞测序等技术，获得数量庞大的候选序列，以与目标种属蛋白特异性结合、功能活性等评价方法作为主要评价策略进行多轮筛选。但目前越来越多的研究者将成药性评价提前至抗体药物发现阶段，有利于尽早评估和解决候选药物的可开发性问题，最终获得一个均一、稳定、安全、有效和可放大生产的候选序列，提高药物开发的成功率和效率。

抗体药物早期发现阶段的成药性筛选流程划分为成药性初期评价、成药性筛选和成药性评估3个阶段。成药性初期评价和筛选阶段，样品种类多、数量大，综合时间进度和有限的资源，采用倒漏斗型筛选策略，选择少量且关键的质量属性进行评价，同时配合高通量技术加快评估流程；对中后期筛选出的分子，应进行多维度且较为全面的质量属性的表征；对最终筛选出的分子，应增加加压实验等研究，以获得更为全面的分子属性。值得注意的是，在抗体药物发现阶段，成药性筛选评估没有绝对的标准对候选分子进行剔除，而是对候选分子综合评估后，打分排序(如风险等级按高、中、低排序)，帮助及时了解候选药物的分子属性和潜在风险因素，掌握控制要点，便于后续工艺和制剂的开发。

developability-workflow

成药性初期评价

非人源的抗体候选序列（如杂交瘤筛选技术）获得后，需先构建为嵌合抗体，即对候选序列进行恒定区人源IgG1或IgG4代替，使用哺乳动物细胞系（人源胚胎肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞等）表达；对于筛选获得的人源序列，可以直接进行质粒构建和表达；对于抗原结合片段库（Fab）、单链抗体可变区基因片段库（scFv）和单域抗体库（dAb）筛选得到的序列，可以制备成IgG-like的形式，也可以选择合适的表达体系进行单独表达。此阶段的表达方式一般为瞬转表达，有利于快速获得小体系样本，经高通量设备纯化，得到具有一定纯度的样品。

此阶段是以活性筛选策略为主，包括结合活性[酶联免疫吸附技术（ELISA）、流式细胞技术（FCM）]和功能活性（天然细胞、工程细胞），还可以借助高通量分子相互作用仪，如基于表面等离子共振技术（SPR）的Biacore^TM 8K系列仪器或者基于生物膜干涉技术（BLI）的Octet^® BLI系列仪器，检测与目标种属靶抗原的特异性、亲和力、结合动力学和表位竞争等。在保证项目进度的前提下，可选择关键物理化学属性进行成药性初期评价，包括表达量和纯度。纯度可通过高通量技术进行检测，如体积排阻色谱-高效液相色谱（SEC-HPLC）法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法或毛细管凝胶电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）法等。瞬转表达量与稳转表达量具有一定的相关性，筛选高表达量的分子，同时选择不易形成聚集或降解的分子，不仅可以降低后期生产成本，还代表着具有更优的构象稳定性和胶体稳定性，也为体外活性检测奠定基础，避免因聚集体或降解物过多导致结果失真。

筛选出的序列若用于制备双特异性抗体，应在此阶段进行组装考察，评价活性和稳定性，可以通过构建质粒表达，也可以借助体外重组技术完成。评估项目包括表达量、纯度和活性，值得注意的是：纯度检测项应根据分子及其变异体性质的差异选择合适的评价策略，如可根据电荷差异通过离子色谱-高效液相色谱（IEX-HPLC）和成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等方法进行表征，也可根据分子量大小通过SEC-HPLC和毛细管凝胶电泳法表征。

筛选出的序列若用于制备抗体偶联药物，可在此阶段进行偶联，评价分子偶联效率和稳定性，如通过SEC-HPLC等方法检测聚体和片段的含量、通过疏水相互作用-高效液相色谱（HIC-HPLC）法或质谱法检测ADC的偶联量及偶联位点的分布、通过质谱法检测小分子脱落量和通过ELISA法或质谱法检测血浆稳定性等。

成药性筛选

经以上步骤筛选出的分子，借助高通量计算机模拟和分析技术，对氨基酸序列、分子结构、蛋白质和蛋白质相互作用进行初步分析和预测。针对抗体中的非人源性成分，进行人源化改造，以降低在人体内出现免疫原性的风险，保留抗体互补决定区非人源氨基酸残基，其余均替换为人抗体的相应部分，或改造暴露在抗体表面的骨架区的非人源氨基酸残基；对于全人源抗体库筛选出的人源抗体，需进行亲和力成熟等改造。不同的突变改造可能会影响分子稳定性，应综合考虑平衡亲和力、免疫原性和分子稳定性；对于其他潜在的一些问题，如等电点、脱酰胺、异构化、暴露的色氨酸和蛋氨酸、未配对半胱氨酸、糖基化或糖化等也应给予关注和改造，如等电点过高可能会影响半衰期，等电点过低在常规的工艺过程中易产生聚集；互补决定区的脱酰胺、异构化导致分子降解或者活性降低；氧化可能会影响活性，也可能引发聚集体的产生；可变区的糖基化或糖化位点，可能会影响活性和稳定性等等。

改造后的分子通过轻重链的组合配对，产生一系列的变体，数量一般在100个左右，通过哺乳动物细胞瞬转表达和高通量纯化（依据活性实验需求进行内毒素控制），评价表达量、纯度和生物学活性，去除极差分子后，开展成药性筛选评价。

成药性筛选阶段的目标为对各分子的固有属性进行评估和排序，如电荷变异体含量、疏水性、热稳定性、不同粒径聚集体、自相互作用、非特异性相互作用、与不同种属抗原的亲和力、表位差异、Fc功能等。最终挑选出具有较低异质性、较高稳定性、较长半衰期、高产量和可工艺放大的抗体，筛选出的分子数量一般小于5个。本阶段成药性筛选所用到的检测技术，应具备样品用量少、通量高、分析快速等特点。若候选分子具有特殊属性，可在此阶段增加初步的稳定性评估，以确保样品在检测、存储、动物给药过程中的稳定，如室温稳定性、2−8℃稳定性、冻融稳定性等。若候选分子计划用于制备高浓度剂型，可以增加溶解度预测实验，随着蛋白浓度的升高，相较于低浓度溶液，蛋白与蛋白之间的作用力增强，但传统的溶解度测定方法对蛋白消耗量大，故可选用在较低浓度中预测溶解度的方法。

成药性评估

对于最终筛选出的几个候选分子，进行进一步的可开发性评估。表达阶段扩大瞬转体系，纯化阶段增加精纯步骤，并严格控制内毒素含量，为早期的动物体内药代动力学（pharmacokinetics, PK）、药效动力学（pharmacodynamics, PD）以及毒理研究储备样品。成药性筛选阶段进行的成药性表征方法应再次检测和确认，另外还应进行加压实验的考察，有助于快速地暴露分子的风险位点及变化趋势，考察对抗体特异性和功能活性的影响程度，考察分子的耐受性和可及性，评估敏感条件，预测长期稳定性，如设置40℃高温稳定性，纳米抗体可进行100℃高温稳定性考察。通过翻译后修饰、聚集体和降解物含量、酸碱变异体含量、ADC中小分子脱落量的变化，发现分子潜在的翻译后修饰位点、降解位点及变化趋势；还可以设置强酸、强碱、氧化和光照等加压实验；对于高浓度制剂的开发，在前期溶解度预测实验中，由于高的稀释因子，难以准确推导高浓度制剂真实的溶解度和黏度，故在此阶段，可以开展目标浓度的浓缩和过浓缩，使用常用缓冲体系，添加尽可能少的制剂辅料，观察药物在浓缩过程中的特性，包括但不限于蛋白含量、聚集体和降解物的含量、粒径的尺寸分布和分散度、黏度、热稳定性、储存稳定性以及在高浓度下与血清的相融性等。最佳配方条件的探索，则应在后期制剂开发中进行。