抗体药物偶联物（ADC）中抗体结构的设计和功能改造

抗体药物偶联物（ADC）偶联肿瘤抗原特异性单克隆抗体mAb、稳定的化学linker与强效细胞毒素，将单抗的选择性与化疗药物的细胞毒性潜力相结合。这三种组分共同产生了一种强大的溶瘤剂，能够在抗体对肿瘤靶标的高亲和力的引导下，特异性地将正常耐受的细胞毒性药物递送到癌细胞（图1）。

在过去的十年中，对于ADC研究工作集中在linker和优化有效载荷上。抗体作为传递细胞毒性有效载荷的重要机制，与抗体独特结构特征相关的其他潜在影响仍在探索之中。

图1 ADC各组成部分及其在ADC设计、工程和功能中的作用。

Fab区域：靶标的选择和特异性

ADC的成功开发取决于选择合适的靶抗原，这是ADC疗效的决定因素。ADC等靶向疗法利用癌细胞和正常细胞之间蛋白表达的差异来选择合适的靶抗原。目前正在开发的靶标包括HER2（即曲妥珠单抗美坦新）和CD30（即布伦妥昔单抗维多汀）。人们普遍认为，靶抗原应在肿瘤细胞表面均匀且选择性地表达，在正常组织中很少或没有表达，以限制脱靶毒性。
ADC的靶标验证必须基于靶抗原的可靠鉴定。基因组研究指出，肿瘤细胞具有复杂的异质性，存在不同细胞亚群，不同亚群具有独特的表型多样性，这些差异来源于肿瘤内和肿瘤间遗传和非遗传的异质性影响。这对靶标的选择提出了深刻的挑战。虽然ADC疗法并非要求靶抗原表达绝对均匀（异质性肿瘤可能因旁观者效应而使治疗效果提升），但最新临床开发中的ADC主要适用于具有基本一致的谱系特异性标志物的血液肿瘤适应症。

传统对靶抗原的选择主要集中在肿瘤细胞上表达部分，然而人们对靶向肿瘤微环境中存在的抗原越来越感兴趣，包括新生血管、内皮下基质和肿瘤基质内的抗原。靶向基质的ADC通过降低基质产生的生长因子的浓度导致肿瘤细胞死亡。由于所有肿瘤细胞的存活都依赖于血管因子和基质细胞生长因子，因此靶向此类组织的ADC可能具有更广泛的疗效。这种靶向策略特别有吸引力，因为与癌细胞不同，这些细胞在基因组上是稳定的，并且不太可能产生与突变相关的耐药性。

靶抗原应通过受体介导的内吞作用很好地内化，不应因内吞作用或治疗期间重复刺激而使得作用下调。为了使ADC产生临床效果，抗原表位的识别必须导致内吞作用。一般来说，内化良好、在正常组织上表达低、在肿瘤上表达高的抗原是ADC方法的首选。然而，临床试验的结果表明，健康组织中的靶抗原表达可能会导致脱靶毒性难以预测。与非偶联抗体功能不同，目前的实验证据通常表明抗原密度与ADC的功效没有直接关系。对淋巴瘤、黑色素瘤和前列腺癌的研究表明，ADC的抗原密度与治疗反应之间没有直接相关性，ADC疗效的发挥需要最低抗原表达阈值。

Fc区域：抗体支架和对功能的潜在影响

ADC的抗体部分的主要作用是选择性地将细胞毒性药物递送到靶细胞。因此，在设计ADC时，对抗体中负责抗原识别的Fab部分给予了很大的关注。用于开发ADC的抗体主要是全长抗体，几乎完全属于IgG类。然而，对抗体的Fc段的考虑较少。

1）对效应功能的影响

IgG抗体的Fc段包含与新生儿Fc受体（FcRn）的结合结构域，可调节血清半衰期，并识别免疫效应细胞上不同的活化和抑制性Fc受体，这些受体可影响生物利用度、组织隔离、肿瘤转运、抗原靶向和免疫功能。

完整的IgG ADC能够将补体成分和免疫效应细胞募集并激活到肿瘤部位，介导二级免疫功能，如补体依赖性细胞毒性（CDC），抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）。ADC触发免疫效应功能的能力可以提高抗肿瘤活性，也可以通过循环中的免疫细胞隔离ADC并影响ADC在肿瘤部位的定位和靶细胞内化，或者被免疫细胞内化导致脱靶毒性。研究表明，裸抗与相应的ADC之间具有相似的抗体介导的效应功能。相反，也有研究确定Fc受体会引起ADC治疗副作用。T-DM1已被证明可通过与FcγRIIa结合，在体内被巨核细胞内化，这与T-DM1诱导的血小板减少症的发展有关。除了FcγRIIa结合之外，还有其他机制，例如巨胞饮作用，这就可以解释巨核细胞非受体/非靶点介导的摄取而引起的血小板减少症。

综上所述，根据肿瘤的类型、抗原的表达以及抗体对抗原的亲和力，设计具有Fc介导功能的ADC是合适的，可以通过选择合适的IgG亚星或设计Fc区域来优化ADC。

2）抗体亚型的影响

IgG有4个亚型，到目前为止除IgG3外的所有亚型都已用于开发目前正在临床试验中的ADC。

IgG1是ADC设计中最常用的亚型。它具有与IgG2和IgG4相当的血清稳定性（21天），但具有更强的补体固定能力和更高的亲和力，激活单核细胞和巨噬细胞（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa）和NK细胞（FcγRIIIa）等效应细胞上表达的FcγR。因此，该亚型具有激活免疫系统并触发CDC，ADCC和ADCP的卓越能力。

IgG3具有锚定补体、结合激活FcγR的优越能力，但与其他亚型相比，IgG3在血清中的半衰期较短，其长铰链区易于被水解以及潜在免疫原性，迄今为止IgG3亚型的抗体在ADC开发中尚未被采用。

IgG2、IgG4锚定补体的能力较弱，且对FcγR的亲和力较低。当不需要激活免疫系统时，IgG2和IgG4可用于治疗性抗体的设计。IgG2有四个二硫键，而IgG1和IgG4只有两个，因此它似乎更适合搭载更高DAR的马来酰亚胺接头。IgG2也能够形成二聚体，但二聚化对治疗效果的影响需要更深入的研究。IgG2 ADC，如AGS-16M8F（抗ENPP3 IgG2-MMAF），目前正在临床试验中进行评估。

IgG4是具有非常不寻常特征的亚型，例如能够与其他IgG4抗体进行Fab臂交换（FAE），因此可以导致双特异性和功能单价形式，抗靶标功能降低。因此，通常引入特定的单点突变可以稳定抗体并预防FAE。尽管与IgG1相比，IgG4激活FcγR的亲和力较低，但对FcγRI的亲和力足以进行功能激活，并且其去岩藻糖基化形式能够结合FcγRIIIa。因此，在设计IgG4的ADC时，需要考虑免疫细胞活化。FDA在2000年批准的第一个ADC就是使用IgG4亚型抗体（Gemtuzumab ozogamicin, anti-CD33 IgG4-Calicheamicin），该药由于批准后的研究显示患者生存率没有明显改善，于2010年自愿退出市场。然而，这种ADC今年已被重新批准用于治疗急性髓性白血病。目前更多的IgG4 ADC正在临床试验评估中。

3）Fc段的工程策略

调节ADC参与免疫系统反应能力的另一种方法是设计其Fc的结构域，最广泛使用的方法是抗体糖工程。

如果选择的抗体亚型是IgG1，可以在Fc段引入单点突变或突变组合，以增强或减弱IgG1与FcγR或补体（C1q）的结合，从而增强或减弱ADCC、ADCP或CDC。举个例子，I期临床试验的MEDI4276（anti-HER2 IgG1-tubulysin analogue）通过三个单点突变（E234F，S239C和S442C）以减少FcγR结合，目的是最大限度地减少T-DM1引起的血小板减少症。

Fc改造也可用于改善ADC的药代动力学。人源化IgG1 MEDI-524-YTE，具有三个单点突变（M252Y，S254T和T256E），以增强IgG1与FcRn的结合。与野生型抗体相比，MEDI-524-YTE在食蟹猴中的血清半衰期增加了四倍。值得研究的是，增加FcRn结合和延长半衰期是否会导致ADC的活性增加和毒性降低。

4）基于生物分布考虑的ADC设计

独立的小分子治疗剂可以在体内广泛分布。相比之下，ADC通常保留其抗体成分的药代动力学特性，因此表现出相对较低的清除率和更长的半衰期。

尽管对治疗性抗体进行了优化，且抗体对肿瘤的亲和力高于正常组织，但到达肿瘤的抗体量仅为给药量的一小部分（约1-2%）。抗体片段（如Diabody）比IgG小得多（约50 kDa），因此具有卓越的组织穿透能力。然而，由于它们的尺寸较小且缺乏通常与FcRn结合的Fc部分，因此抗体的清除速度比全长IgG快得多。研发中的抗CD30-Diabodies-药物偶联物已经显示出很高的抗肿瘤活性，但是，在ADC设计中使用的Diabodies需要进一步研究和优化，以便在最佳组织渗透和低清除率之间取得平衡。

小结

在过去的十年中，ADC研究工作集中在linker和优化细胞毒性有效载荷上。ADC的抗体支架为肿瘤相关抗原提供所需的特异性，将细胞毒性药物转运到癌症组织。然而，如何筛选适合抗体及其结构特征的潜在临床效果仍然没有得到很好的探索，甚至可能没有得到充分利用。
在设计下一代更有效、特异性更强的ADC时，我们可以考虑通过抗体部分的结构来进行优化。选择合适偶联方法可以保持抗体稳定性，并且在需要时募集和优化免疫细胞的参与。将来，具有特定抗体同种型的Fc结构或改造后的Fc结构可能会提供更好的生物分布控制，并改善免疫细胞的参与和激活。以抗体结构属性为依据的新颖设计方法将为下一代ADC的成功做出贡献。

参考文献
Ricarda M. Hoffmann, Ben G. T. Coumbe, Debra H. Josephs, et al. (2018) Antibody structure and engineering considerations for the design and function of Antibody Drug Conjugates (ADCs), OncoImmunology, 7:3, DOI: 10.1080/2162402X.2017.1395127

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