酶免疫组织化学技术

酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIT）是免疫组织化学中最常用的方法之一，是在一定的条件下，应用酶标记抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生特异性免疫反应，在酶的催化作用下催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。
酶免疫组织化学具有以下优点：①无需特殊显微镜设备；②定位准确，且对比度好；③酶标染色标本可长期保存；④可使用苏木素-伊红染料复染，与形态学相结合，便于观察结果；⑤显色反应的底物易分辨，电子密度大，便于光镜及电镜观察；⑥根据酶和底物的不同显示不同颜色，可进行双重或多重染色。尤其是非标记抗体酶法的灵敏度更优于荧光免疫技术。由于以上优点使酶免疫组织化学技术成为临床病理诊断、肿瘤性质判断及预后观察的重要手段。

常用标记酶

1. 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
   HRP广泛分布于植物中，以辣根中含量最高而得名。分子量为44kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在波长275nm。通常HRP的纯度用纯度数（reinheit zahl，RZ）表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示的。酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmli底物转化为产物所需的酶量。用于酶免疫技术的HRP的RZ值应大于3.0，活性＞250u/mg。
   常用的显色底物为DAB（3,3’-二氨基联苯胺），偶尔用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物未棕褐色，有嗜锇性。HRP的优势在于易于提取，价格相对低廉；同时性质稳定，易于保存，与抗原或抗体偶联后活性很少受影响。
2. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）
   ALP是一种磷酸酯水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜中提取，但两种来源的ALP理化性质存在差异：菌源性ALP分子量为80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜来源ALP分子量为100kD，最适pH为9.6；肠黏膜来源ALP的活性高于菌源性ALP。ALP用于酶免疫技术时必须注意，含磷酸盐的缓冲液对酶活性具有抑制作用。因为在酶免疫技术中所使用的温育和洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液（PBS），含有相对高浓度的磷离子（15mmli/L），对碱性磷酸酶有很强的抑制作用，尽管最终显色反应的底物在另一种缓冲液中，但先前残留的PBS足以抑制大约一半的酶活性。因此如试剂盒注明标记酶为碱性磷酸酶，则温育和洗涤缓冲液不能使用PBS溶液。在酶免疫技术中应用ALP系统，其灵敏度一般高于HRP系统，空白值也较低，但由于ALP较难获得高纯度制剂，稳定性较HRP差，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，故其应用不如HRP普遍。
   常用的显色底物为磷酸萘酚AS-MX，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生产不溶性染料（坚牢蓝或坚牢红）。
3. 葡萄糖氧化酶（GOD）
   GOD所催化的底物为β-D-葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝（P-Nitroblue Tetrazliium）,终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故GOD主要用于ICC双重染色和两种酶的放大技术。
   两种酶的放大技术使用GOD和HRP分别标记第二与第三抗体，并用含有β-D-葡萄糖和DAB的孵育液（β-D-葡萄糖被GOD氧化生成H2O2，又作为HRP的催化底物，与DAB发生显色。
4. β-D-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）
   β-Gal是一种来源于大肠杆菌的四聚体蛋白，分子量约为540kD，最适pH为6.0～8.0。由于人类血液标本中缺乏此酶，以其制备的酶标记物在测定时不易受到内源性酶的干扰，特异性较强，故常用于均相酶免疫测定中。

酶免疫组织化学技术的分类

酶标记抗体

借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体上形成酶标抗体，酶标抗体与靶抗原反应后，通过酶对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物。常用的方法有直接法和间接法。
①直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。直接法操作简便但灵敏度低，此外需要依据不同抗原制备相应的酶标抗体。
②间接法：将酶标记在第二抗体上形成酶标二抗，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标二抗）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物，最后用底物显色剂显色。间接法检测灵敏度高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体，但特异性不如直接法，可能会出现假阳的情况。

非酶标记抗体

非酶标记抗体技术使用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应使得抗酶抗体与组织抗原结合。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的灵敏度。它有以下几种技术类型：
①酶桥法
抗酶抗体作为第三抗体，通过桥联抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。酶桥法较酶标法的灵敏度有所提高，但操作更为复杂。在酶桥法中，如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉；如果酶标记在非特异性抗体上就会存在背景着色问题；同时抗酶抗体的非特异性成分也能竞争结合桥联抗体的结合位点，影响方法的灵敏度。

与酶桥法相比，PAP复合物结构稳定，避免了酶桥法中酶标记易脱落的弊端；灵敏度高，较桥酶法灵敏20倍；PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色。

（三）双桥PAP法

双桥PAP法的基本原理是通过两次连接桥联抗体和PAP复合物，使得双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子，以增强灵敏度。这种使用桥联抗体放大的方法，使桥联抗体与PAP复合物中抗酶抗体的未饱和Fc段结合，或桥联抗体与特异性第一抗体尚未饱和的Fc段结合，从而达到对抗原的明显放大效果，对于组织细胞微量抗原的检测有实用价值。

参考文献
[1]王兰兰，许化溪.临床免疫学检验（第5版）[M].北京：人民卫生出版社，2012
[2]吴秉铨，刘彦仿.免疫组织化学病理诊断[M].北京科学技术出版社，2007.

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