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在原核蛋白表达体系中,如E.coli(大肠杆菌表达系统),外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达,本文详细讲述了常用诱导剂IPTG诱导原理,对外源蛋白诱导表达原理以及实验步骤。
原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列,且密集于染色体上,共同形成一个转录单位——操纵子,也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基转移酶(transacetylase);此外还有调控基因:操纵序列O(operator)、启动序列P(promoter);而I(编码Lac阻遏物,Lac repressor)不属于乳糖操纵子。
乳糖操纵子结构基因
Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态,Lac阻遏物(即下图中的阻遏蛋白)能与操纵基因O结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,阻止了转录的路径,从而抑制转录启动。而当有诱导剂(这里指IPTG)存在时,诱导剂可与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白构象发生变化,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来,RNA聚合酶不再受阻碍,启动子P开始发生转录,启动反应开始发生转录。
在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中,通常选用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,IPTG是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
IPTG诱导表达原理图
试剂和培养基 | 配料 |
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LB(Luria—Bertani)培养基 | 酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0 |
IPTG 贮备液 | 2g IPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存 |
凝胶电泳加样缓冲液 | 50mmol/L Tris-CL(pH6.8) 50mmol/L DTT 2%SDS(电泳级) 0.1%溴酚蓝 10%甘油 |
2. 表达鉴定第二天的任务,注意Pcold表达载体的表达温度
3. 表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度
4. 蛋白纯化:见蛋白纯化专题
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