SUMO标签融合蛋白表达SOP

在真核细胞中，小分子泛素相关修饰（small ubiquitin-like modifier, SUMO）是一种可逆性翻译后修饰。SUMO蛋白已被证明在多种细胞过程中发挥重要作用，如细胞核-胞浆转运、细胞凋亡、蛋白激活和稳定性、应激反应和细胞周期的进程。除了在真核生物中具有生理意义外，SUMO在原核和真核细胞蛋白表达系统中还可以作为一种强大的生物技术工具。SUMO作为N端融合伴侣，能够显著提高蛋白的稳定性和溶解性，从而提高功能性蛋白的产量。在表达和纯化融合蛋白后，SUMO标签可以在体外被特定的SUMO蛋白酶通过其内肽酶活性切割，从而产生所需蛋白的N端。

实验试剂与仪器

1. 将目的基因克隆到pSUMO载体

• pSUMO载体
• 包含目的基因的DNA
• PCR试剂盒（高保真DNA聚合酶，10倍反应缓冲液，dNTP核苷酸混合物）
• DNA限制酶和反应缓冲液
• PCR纯化试剂盒
• 50°C水浴
• DNA凝胶回收试剂盒
• TAE缓冲液：40 mM Tris, 1 mM EDTA, 20 mM乙酸, pH调至8.5
• 琼脂糖凝胶
• T4 DNA连接酶及其反应缓冲液
• 感受态大肠杆菌TOP10细胞
• LB培养基（液体）
• LB琼脂平板加适当的抗生素
• 质粒DNA小量提取试剂盒

2. 大肠杆菌表达菌株的转化和蛋白表达的诱导

• SOC培养基
• LB培养基（液体）
• 卡那霉素：50 mg/mL（1000倍浓缩）
• 摇床
• 离心机

3. 大肠杆菌细胞裂解获得可溶性蛋白和包涵体

• 无菌35 mL离心管
• PBS
• 裂解缓冲液：含150 mM NaCl、10 mM咪唑和1% (v/v) Triton X-100的PBS
• 包涵体洗涤缓冲液：含0.5% (v/v) Triton X-100, 1 mM EDTA和1 M尿素的裂解缓冲液
• 包涵体增溶缓冲液：50 mM CAPS-KOH, pH 11, 0.3 M NaCl, 0.3% (w/v) N-laurylsarcosine, 1 mM DTT。
• DNase
• RNase
• PMSF
• IPTG
• Triton X-100
• 透析缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl，10%甘油

4. 从大肠杆菌可溶性提取物和可溶性包涵体中亲和纯化SUMO标签蛋白

• Ni-NTA树脂
• 裂解缓冲液（同上）
• 洗涤缓冲液1：额外含有150 mM NaCl, 5 mM咪唑，1% (v/v) Triton X-100的PBS
• 洗涤缓冲液2：额外含有150 mM NaCl, 15 mM咪唑的PBS
• 洗脱缓冲液：含150 mM NaCl, 300 mM咪唑的PBS。
• 再生缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 100 mM EDTA，0.5 M NaCl
• 包涵体增溶缓冲液（同上）
• Charge buffer：50 mM NiCl2。
• 20% (v/v)乙醇。
• 透析缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 10%甘油。

5. SUMO蛋白酶对SUMO标签的切割

• SUMO蛋白酶
• PBS
• 复性缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (w/v) CHAPS, 10% (v/v)甘油
• 1M DTT
• 3.5 kDa MWCO 透析管

实验步骤

1. 利用BsaI定向克隆pSUMO载体中

• 设计PCR引物。正向引物和反向引物分别使用序列5′-NNN GGT CTC NA GGT XXX XXX XXX XXX XXX-3’和5′-NNN GGT CTC TCT AGA TCA YYY YYY YYY YYY YYY-3’作为模板。X表示对应于目的基因5’末端的核苷酸，Y表示对应于与其3’末端反向互补的核苷酸。N表示任何核苷酸，BsaI位点用粗体表示，XbaI位点以粗斜体显示。
• 使用高保真DNA聚合酶和设计引物PCR扩增感兴趣的基因。
• 使用PCR纯化试剂盒清除PCR反应。
• 反应管内用BsaI限制性内切酶（10 U）在50℃分别消化pSUMO载体和PCR产物1小时，并在1% (w/v) TAE琼脂糖凝胶上以10 V /cm运行30分钟，分离反应样品。
• 使用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中分离回收PCR片段。
• 以1∶3的比例混合载体和PCR片段，建立20 µL的连接反应体系。
• 在室温下将反应混合物孵育2 h。
• 用5 µL的反应混合物转化50 µL的感受态大肠杆菌TOP10、DH5α或其他适合克隆的菌株。
• 将3 mL含有阳性菌落的培养物接种在LB液体培养基中，并在37℃振荡生长过夜。
• 在4000g转速下离心5 min，并丢弃培养基。
• 使用质粒DNA小量提取试剂盒分离质粒。序列确认后进行大肠杆菌表达菌株的转化。

2. 大肠杆菌菌株的转化与培养

使用大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达SUMO融合蛋白。该菌株通常用于可诱导的T7 RNA聚合酶驱动的高水平基因表达。为了减少快速产生蛋白在细胞中的降解，从该菌株的基因组中删除了两种主要蛋白酶OmpT和Lon的基因。

• 在冰上解冻待转化的细胞，使细胞始终保持尽可能低的温度。在任何时候都尽可能轻柔地操作细胞。在转化和培养大肠杆菌时，必须无菌操作。
• 将1.5 mL无菌离心管中加入50 µL细胞悬液及1µL DNA溶液（约0.1µg）。
• 用移液器吸头混合并在冰上培养15-30分钟。
• 将离心管从冰上移开后立即浸入42℃水浴中40 s，对细胞进行热休克。然后把离心管放回冰上。
• 放置在冰上2分钟后，加入200 µL37℃预热的SOC。
• 细胞在37℃摇床中培养1 h。
• 将0.1 mL转化培养物无菌转移到含有50 mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上。
• 在点燃的本生灯下用无菌播散器均匀播散转化培养物。
• 将平板在37℃培养箱中培养过夜。
• 将5 mL LB培养基移入无菌15 mL离心管中。加入5µL 1000倍卡那霉素溶液（最终浓度50µg/mL）。
• 使用接种环接种该培养液中转化表达质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌株的单个菌落。
• 在37℃下振荡（250 rpm）培养过夜。
• 使用无菌量筒取1 L LB加入无菌2.5 L烧瓶，加入卡那霉素至最终浓度为50 μg/mL。
• 将5 mL起始培养物接种到2.5 L烧瓶中。
• 在37℃下振荡培养（rpm=250）约3 h，直至细胞密度OD600nm达到0.5。
• 取出1 mL培养物作为阴性诱导对照。4000g离心15 min收集细胞，并将沉淀保存在-80℃。
• 加入IPTG，最终浓度为1 mM。在37℃振荡培养3小时或在20°C培养16小时。4000g离心15分钟收获细胞。

3. 细胞裂解及可溶性蛋白、包涵体的分离

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质沉淀。SUMO标签通常可以提高蛋白质的溶解度，因此SUMO融合蛋白很可能在可溶性部分中发现。然而，在某些情况下，即使是SUMO标签的融合蛋白也会在大肠杆菌中错误折叠并形成包涵体。

3.1 大肠杆菌可溶性部分的分离

• 通过离心（4000g，15 min，4℃）从LB培养基中收获大肠杆菌，每升培养物获得的培养细胞的典型湿重约为10-12 g。
• 倾析培养基并将细胞沉淀重新悬浮于裂解缓冲液（每1 g细胞3 mL裂解缓冲液）中。
• 在冰水上用超声（50%输出功率，5×30 s，脉冲周期之间间隔1分钟）裂解细胞。
• 向裂解液中加入DNase和RNase（20µg/mL），冰浴20 min。
• 样品中加入Triton X-100，最终浓度为1% (v/v)，4℃孵育1 h。
• 样品离心（20000 g, 30 min, 4℃）；保存上清液为可溶性蛋白部分并保留沉淀用于制备不溶性蛋白。

3.2 大肠杆菌包涵体的溶解

• 用30 mL包涵体洗涤缓冲液洗涤1 L培养液中的上述制备沉淀，方法是重悬并在4℃下以10000g离心10min。
• 弃去上清液，如上所述重复两次洗涤步骤。
• 向沉淀中加入30 mL包涵体增溶缓冲液，在室温下振荡1 h以提取不溶性蛋白质。
• 4℃下以15000g离心30 min，取上清液作为不溶性蛋白部分。
• 通过SDS-PAGE，根据分子量对上述制备的可溶性和不可溶性部分进行分析。
• 立即将蛋白样品用于纯化或将其在4℃下储存短时间(少于10天)。长期储存应在-80℃;避免反复冻融循环。

4. 用Ni-NTA树脂亲和纯化SUMO标签蛋白

可以利用SUMO N末端的6xHis亲和标签使用Ni-NTA树脂亲和纯化SUMO融合蛋白。这是一种从细菌溶解物中提纯蛋白非常有效且相对便宜的方法。从可溶性蛋白和从包涵体中溶解的蛋白的纯化方案在缓冲液组成方面是不同的，因此在此进行区分。

4.1 可溶性蛋白纯化

• 用移液管将 25 mL Ni-NTA树脂移入色谱柱中，让其在重力作用下排出。
• 用5柱体积的水冲洗柱子。
• 用5柱体积charge buffer挂镍。
• 用10柱体积的洗涤缓冲液1平衡柱子。
• 上样，确保样品含有5 mM咪唑。
• 用10柱体积的洗涤缓冲液1冲洗柱子。
• 用10柱体积的洗涤缓冲液2冲洗柱子。
• 用4柱体积的洗脱缓冲液洗脱结合的SUMO融合蛋白。
• 加5柱体积的再生缓冲液冲洗柱子。
• 用5柱体积的水冲洗柱子。
• 用5柱体积的20% (v/v)乙醇冲洗柱子，允许½体积的乙醇重力排出，并存储在4℃的层析柜中待用。

4.2 包涵体蛋白纯化

• 用10柱体积含5 mM咪唑的包涵体增溶缓冲液平衡预充柱。
• 上样，确保样品含有5 mM咪唑。
• 用10柱体积含5 mM咪唑的包涵体增溶缓冲液冲洗柱子。
• 用10柱体积含15 mM咪唑的包涵体增溶缓冲液冲洗柱子。
• 用4柱体积含300 mM咪唑的包涵体增溶缓冲液洗脱。
• 加5柱体积的再生缓冲液冲洗柱子。
• 用5柱体积的水冲洗柱子。
• 用5柱体积的20% (v/v)乙醇冲洗柱子，允许½体积的乙醇重力排出，并存储在4℃的层析柜中待用。

5. 用SUMO蛋白酶切割SUMO标签并进一步纯化

这是无标签蛋白纯化的最后一步。SUMO蛋白酶以高度特异性的方式识别SUMO三级结构，可以完全去除SUMO标签，最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。在使用SUMO蛋白酶切割SUMO融合蛋白后，混合物再次使用镍柱纯化。由于SUMO标签和SUMO蛋白酶都含有6xHis亲和标签，因此切下来的SUMO标签和SUMO蛋白酶结合在柱上，而无标签的蛋白可以在流穿的过程中被回收。

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SUMO蛋白酶

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