表 1-1主要药品及生化试剂
| 主要试剂 | 生产厂家 |
|---|---|
| 二硫苏糖醇（DTT） | 生工生物工程(上海)股份有限公司（BBI） |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | BBI |
| 三羟甲基氨基甲烷（Tris） | BBI |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | BBI |
| 氯化钠（NaCl） | BBI |
| 甘油（Glycerol） | BBI |
| 咪唑（Imidazole） | BBI |
| IPTG | BBI |
| 硫酸卡那霉素 | BBI |
| Trition X-100 | BBI |
| 蛋白浓度测定试剂盒 | 上海碧云天生物技术有限公司 |
| Ni-IDA琼脂糖凝胶 | 南京德泰生物工程有限公司 |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | 南京德泰生物工程有限公司 |
| SDS-PAGE电泳缓冲液 | 南京德泰生物工程有限公司 |
| SDS-PAGE预制胶 ECL试剂盒 |
南京德泰生物工程有限公司 |
| SDS-PAGE Marker和 WB Marker | 南京德泰生物工程有限公司 |
表 1-2 主要仪器
| 仪器名称 | 型号 | 厂家 |
|---|---|---|
| 恒流泵 | HL-2 | 南京大学普阳分析仪器研究所 |
| 电子天平 | JM-B6002 | 诸暨市超泽衡器设备有限公司 |
| 冷冻干燥机 | FD-1A-50 | 北京博医康实验仪器有限公司 |
| 干式恒温器 | K30 | 杭州奥盛仪器有限公司 |
| 磁力搅拌器 | CJJ-843 | 金坛市金城国胜实验仪器厂 |
| 超净工作台 | SW-CJ-ZD | 苏州净化设备有限公司 |
| 台式全温摇床 | QHZ-98A | 太仓市华美生化仪器厂 |
| 超声细胞破碎仪 | XO-1200D | 南京先欧仪器制造有限公司 |
| 高速冷冻离心机 | GL21M | 长沙湘智离心机仪器有限公司 |
| 四维旋转混合仪 | BE-1100 | 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 |
| 紫外分光光度计 | 722S | 上海菁华科技仪器有限公司 |
| ÄKTA蛋白纯化仪 | ÄKTA prime plus | General Electric Company |
| 隔水式恒温培养箱 | GNP-9050BS-Ⅲ | 上海新苗医疗器械制造有限公司 |
| 电热恒温鼓风干燥箱 | GZX-GF101-3-BS-Ⅱ | 上海跃进医疗器械有限公司 |
| 立式压力蒸汽灭菌器 | LDZM-80KCS | 上海申安医疗器械厂 |
| 蛋白凝胶快速处理系统 | Pyxis® | 南京思普金生物科技有限公司 |
2.1.1 诱导表达及可溶性分析
将构建好的质粒转化到感受态细胞中，然后分别均匀涂布到LB平板上（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素或是100 μg/mL的氨苄青霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。
从转化的平板中挑选单克隆，接种到4 mL的LB培养基中（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素，个别质粒是100 μg/mL的硫酸卡那霉素），待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度 0.2 mM IPTG，之后置于15℃、37℃诱导表达。
2.1.2 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果
取诱导后的培养液12000 rpm离心5 min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10 min，然后离心取上清电泳。
全菌采用20 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole含1% Triton X-100，1 mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测。
2.1.3 扩大培养
根据电泳结果，选取合适条件扩大培养，挑取单菌落接种子液培养过夜，按千分之一的体积比向摇瓶中加入对应抗性，种子液接种量为1%，37℃培养3-4h至OD600为0.6-0.8（若15℃诱导需要提前降温至15℃），加入0.2 mM的IPTG，根据诱导表达结果选择15℃或37℃条件扩大培养，诱导16h后收集菌体。
2.2.1上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）
全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl， 20 mM Imidazole含1% Triton X-100， 1 mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用50mM、100mM、500mM浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。
经Ni-IDA亲和层析纯化，收集纯度浓度相对较高的洗脱组分，然后将其透析到PBS， pH7.4中，透析结束后用0.22 μm滤器过滤，并分装冻于-80℃。
冻融：取一支冻于-80℃的蛋白，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。
复溶：室温下，向蛋白中缓慢加入等体积无菌去离子水重悬，静置5min，无明显浑浊现象且取少量样品离心后无明显沉淀，说明蛋白复溶实验是正常的。
测定蛋白浓度采用Bradford/BCA蛋白浓度测定试剂盒。
WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见对应质检报告。
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