His标签蛋白包涵体表达纯化实验流程

第一部分 实验材料

1.1实验主要药品和生化试剂

1.2 实验主要仪器

第二部分 实验方法

2.1 蛋白表达与鉴定

2.1.1诱导表达及可溶性分析

构建好的质粒转化到感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素或是100 μg/mL的氨苄青霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。

从转化的平板中挑选单克隆，接种到4 mL的LB培养基中（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素，个别质粒是100 μg/mL的氨苄青霉素），待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度 0.2 mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。

2.1.2 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果

取诱导后的培养液12000 rpm离心5 min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10 min，然后离心取上清电泳。

全菌采用20 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole含1% Triton X-100，1 mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测。

2.1.3 扩大培养

根据电泳结果，选取合适条件扩大培养，挑取单菌落接种子液培养过夜，按千分之一的体积比向摇瓶中加入对应抗性，种子液接种量为1%，37℃培养3-4h至OD600为0.6-0.8（若15℃诱导需要提前降温至15℃），加入0.2 mM的IPTG，根据诱导表达结果选择15℃或37℃条件扩大培养，诱导16h后收集菌体。

2.2 蛋白纯化

2.2.1包涵体通过亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）

包涵体采用50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl含1% Triton X-100，2 mM EDTA，5 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，之后用50mM、100mM、500mM不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。

经Ni-IDA亲和层析纯化，收集纯度浓度相对较高的洗脱组分，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液［150mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，1.8mM KH₂PO₄ (pH7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，0.4 M L-Arginine，1 M Urea］中复性，复性后最终透析于储存液150mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，1.8mM KH₂PO₄，10% Glycerol，pH7.4约6-8 h。透析复性结束后，上清用0.22 μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

第三部分 蛋白质检

3.1 蛋白稳定性测试（冻融/复溶实验）

冻融：取一支冻于-80℃的蛋白，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。

复溶：室温下，向蛋白中缓慢加入等体积无菌去离子水重悬，静置5min，无明显浑浊现象且取少量样品离心后无明显沉淀，说明蛋白复溶实验是正常的。

3.2 蛋白浓度测定

测定蛋白浓度采用Bradford/BCA蛋白浓度测定试剂盒。

3.3 蛋白WB检测

WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见对应质检报告。