HEK293细胞分泌蛋白表达纯化实验流程

第一部分 实验材料

1.1实验主要药品和生化试剂

1.2 实验主要仪器

第二部分 实验方法

2.1 转染级质粒扩增抽提

2.1.1 质粒转化

1. 吸取含有目的基因的表达质粒80-100ng加入已制备的DH5α感受态细胞中。
2. 将加入质粒后的感受态细胞通过热激转化。
3. 将转化后的感受态细胞加入LB液体培养基，放入摇床37℃，200rpm震荡培养约30min。
4. 将培养后的感受态细胞取出，吸取部分悬液涂在含有氨苄抗性的平板上，放入培养箱，37℃，过夜培养。
5. 从新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mL LB培养基，37℃，200rpm培养8h。
6. 按1/500比例接种于200mL LB培养基中，37℃，200rpm培养16h。
7. 收集培养后的菌液离心，去掉上清。

2.1.2 质粒抽提

使用Qiagen转染级质粒抽提试剂盒按照说明书进行质粒抽提。

转染级质粒DNA质粒质量测定标准：

2.2 HEK293细胞复苏与传代

1. 提前将水浴锅打开37℃；培养基提前在37℃预热。
2. 从液氮罐中取出冻存的细胞。
3. 把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其快速融化（约1min），取出。
4. 用75%乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内，转移到含10mL培养基的 15mL离心管中，离心800 rpm，5 min。
5. 离心后的细胞去掉上清，取少许新鲜培养基重悬细胞，再转移到培养瓶中，加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，使密度控制在3-5×10⁵ cells/mL，活力>95%。
6. 置于培养箱中110rpm，37℃，8% CO₂培养。
7. 细胞培养2-3天，密度达到2.0-3.0×10⁶ cells/mL 左右时需对细胞进行传代。
8. 从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞培养物稀释（留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定）。
9. 放入培养箱中110rpm，37℃，8%CO₂，继续培养。
10. 每天需对细胞密度及活力检测，当细胞密度达到2.0-3.0×10⁶ cells/mL左右时，要对细胞进行传代。

2.3 HEK293细胞转染

1. 转染前1天将细胞悬浮培养，接种密度为2.0×10⁶ cells/mL，置于培养箱中110rpm，37℃，8% CO₂培养。
2. 转染当天细胞生长至3.0-5.0×10⁶ cells/mL，用新鲜培养基稀释密度为3.0×10⁶ cells/mL进行转染。
3. DNA-转染试剂混合物：向转染缓冲液中加入DNA和转染试剂混匀，37℃温育。
4. 将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃，8%CO₂培养。
5. 转染24h后添加5%补料继续培养。
6. 收集：转染后约4-6天，取出细胞培养物，离心，收集上清。

2.4 蛋白纯化

2.4.1分泌纯化蛋白

取转染培养5天后的细胞培养液离心，上清用0.22um滤器过滤，在4℃环境下透析至缓冲液1×PBS，pH7.4中，透析结束后再用Ni-IDA（针对his标签蛋白）/Protein A（针对FC标签蛋白）柱纯化。

经Ni-IDA/Protein A亲和层析纯化，收集纯度浓度相对较高的洗脱组分，然后将其透析到PBS， pH7.4中，透析结束后用0.22 μm滤器过滤，并分装冻于-80℃。

第三部分 蛋白质检

3.1 蛋白稳定性测试（冻融/复溶实验）

冻融：取一支冻于-80℃的蛋白，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。

复溶：室温下，向蛋白中缓慢加入等体积无菌去离子水重悬，静置5min，无明显浑浊现象且取少量样品离心后无明显沉淀，说明蛋白复溶实验是正常的。

3.2 蛋白浓度测定

测定蛋白浓度采用Bradford/BCA蛋白浓度测定试剂盒/A280紫外光吸收法。

3.3 蛋白WB检测

WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见对应质检报告。