T细胞受体测序（TCR-seq）

T细胞受体（T-cell receptor, TCR）是适应性免疫系统识别并响应外来或异常内源性抗原的核心分子。αβ型T细胞所表达的TCR由α链和β链两条异二聚体组成，二者通过V(D)J重排与连接多样化产生极高的序列异质性，尤其是CDR3区域，在抗原识别中起关键作用。对个体或组织中TCR库（repertoire）的测序，能够以单分子分辨率揭示克隆组成、克隆扩增、抗原驱动选择以及免疫动力学，这些信息对基础免疫学、疫苗评估、肿瘤免疫学、移植免疫监测和自身免疫学均具有直接且不可替代的价值（例如用于追踪治疗响应、识别病理性克隆或构建表位-克隆映射）。因此，TCR-seq已成为现代免疫学研究与临床转化中不可或缺的分子工具之一。

尽管目标清晰，但不同的实验需求（如是否需要α/β配对、测序深度、样品来源、成本限制）导致了方法学上的多样化。总体上，TCR-seq可以分为两大类：bulk（群体）测序和single-cell（单细胞）测序。前者以高深度描绘群体克隆丰度分布，适合群体水平的多样性分析与与免疫反应整体趋势研究；后者在单细胞层面恢复配对的α/β信息并可与细胞转录组或表型数据整合，适合探索克隆功能异质性与细胞状态的关系。

从一代测序到高通量单细胞技术

TCR-seq早期努力依赖传统分子生物学方法与Sanger（第一代）测序。上世纪90年代至2000年代初，研究者通过克隆-分离扩增后的V(D)J片段采用Sanger测序进行少量样本的序列获取。尽管这种方式配对信息较可靠，但因通量极低、成本高昂且难以全局刻画库多样性，其应用仅限于克隆分离或小规模功能研究。此外，早期单细胞配对策略多采用手工分选单个细胞到孔板内，单细胞逆转录、嵌合PCR扩增α、β链，随后对扩增产物进行Sanger测序以得到配对链信息；该方法在能获得高度准确配对信息的同时，通量受限且工作量大。

下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）的出现以及文库制备方法与分析算法的发展彻底改变了TCR-seq领域。NGS使得一次测序可以获取百万级别的CDR3序列，从而能对克隆多样性做定量分析（例如计算Shannon、Simpson指数，绘制克隆谱分布）。在bulk层面，基于multiplex PCR、5′RACE或捕获（capture）探针的文库策略广泛应用于不同样品类型（外周血、组织、FFPE等）。而在单细胞方向，高通量平台方案（如10x Genomics的Chromium V(D)J）以及基于微流控/油包水微滴或者板式分选结合Smart-seq等策略，使得在单细胞水平恢复α/β配对并与scRNA-seq联合成为可行且规模化的研究手段。近年来，长读长测序（PacBio、Oxford Nanopore）与空间转录组技术的加入，又为恢复完整可变区或在原位保持空间信息提供了新契机。总体而言，TCR测序技术的发展呈现出从低通量高准确性到高通量与多组学整合的清晰演进路径。

Bulk TCR-seq

Bulk TCR-seq的目标是在群体水平（通常是组织或外周血样品）获取尽可能全面与定量的TCR库剖面。这类方法的核心在于如何构建代表性的文库并尽可能减少实验偏倚，使得测序得到的克隆频率能真实反映生物学丰度。

在文库构建阶段主要存在三类主流策略：多重引物扩增（multiplex PCR）、5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）与捕获探针富集（hybrid-capture）。

多重引物法通过设计覆盖大部分V与J基因的引物集，对目标区进行PCR扩增；它的优点是对低起始量（如少量细胞或gDNA）敏感、流程成熟且成本较低，但显著缺点是引物间扩增效率不一致会引入系统性偏倚，从而影响克隆丰度的精确量化。为了缓解这一问题，常用技术包括引入UMI（unique molecular identifiers）在逆转录或接头连接时标记原始分子，以便下游去重校正PCR放大误差；或设计平衡化引物池与校准曲线来修正不同V引物的效率差异。

5′RACE则绕开对V区的特异性引物依赖，通过在cDNA 5′端添加接头实现目标扩增，能更全面地捕获V区多样性并降低引物偏倚，但对RNA质量更为敏感（RNA降解会影响5′端完整性），且实验流程相对复杂。

捕获探针法利用一组针对TCR基因组或转录本的寡核苷酸探针在文库层面对片段进行富集，这种策略在处理片段化或损坏的DNA（例如FFPE）时优势显著，且能够实现较为均一的覆盖，但试剂成本、设计与优化复杂度较高。

在测序平台方面，short-read Illumina（如MiSeq、NextSeq）仍然是bulk TCR-seq的主战场，因其高准确性、低错误率及成熟的分析生态。对于读长需求，常用2×150或2×250bp配置以覆盖CDR3区与相邻V/J序列，便于V/J注释与CDR3提取。测序深度取决于样本和研究目标：外周血样本中若目标是全面描绘多样性，常需10^5–10^6 reads/样本；若关注特定低频克隆的追踪，需更高深度或使用富集策略。

Bulk方法的优势在于成本效益与深度，可在较大样本量上做群体学比较与动力学追踪；不足之处为缺乏α/β链配对信息（通常只测β链或分别测两链），且对PCR偏倚与测序误差敏感。因此，bulk常用作群体谱系分析、克隆频率随时间变化跟踪与统计学比较，但在功能验证或需要配对信息的场景（如重构TCR进行功能测试）需要配合单细胞方法或分子配对策略。

Single-cell TCR-seq

单细胞层面的TCR测序有两类历史阶段：一代（Sanger/板式单细胞）策略与基于NGS的高通量单细胞策略。理解两者的原理与适用场景有助于选择合适的实验路径。

基于Sanger的单细胞TCR-seq

在NGS兴起之前，研究者常用手工或流式分选（FACS）将单个细胞分配到96/384孔板中，随后进行单细胞逆转录、利用链特异性引物或嵌合PCR分别扩增α与β链，最终通过Sanger测序获得配对序列。此方法的优点是配对信息准确、序列错误率低、每个克隆可得到完整读长，适合需要高可信度配对信息的小规模研究或功能克隆验证。缺点也显而易见，通量低、人工操作量大且费用较高，难以扩展到处理成千上万细胞的研究。

典型工作流程包括细胞单分选、采用逆转录酶进行cDNA合成、两轮或嵌套PCR扩增分别针对α/β链、琼脂糖胶电泳筛选阳性条带并送Sanger测序。该策略在早期用于从有限样本中获取功能性TCR（用于克隆构建或结构生物学研究）仍有价值，尤其当需要完整可读的V(D)J序列与高保真性时。

基于NGS的高通量单细胞TCR-seq

随着微流控与微滴（microfluidics/droplet）技术的发展，单细胞TCR-seq进入了高通量时代。现代方案可以在一次实验中处理成千至数万细胞，并在许多情况下同时获得α/β配对信息以及单细胞转录组（scRNA-seq）或表面蛋白（CITE-seq）数据。代表性平台包括基于微滴的10x Genomics Chromium，板式Smart-seq2/SMARTer改良版结合V(D)J富集，以及其他微流体或乳液方法。

以10x Genomics的V(D)J workflow为例，其基本原理是在油滴微流控系统中将单个细胞与带有条形码（cell barcode）与UMI的逆转录试剂包封到GEMs中，细胞内mRNA在油滴内逆转录并被标记上相同的cell barcode，随后对cDNA进行扩增，再通过V(D)J特异性扩增回收TCR转录本并构建文库。由于同一cell barcode下能同时捕获α与β链的cDNA，故可恢复配对信息；若在同次实验中构建了scRNA-seq文库，便能在单细胞层面将克隆身份与基因表达谱对应起来，极大地丰富了免疫细胞功能与状态的解读。

NGS单细胞方案的优势在于高通量、能直接获得配对信息并与多组学整合；但存在若干技术与生物学限制：首先，检测灵敏度有限，若某细胞的TCR转录本表达极低，可能无法被捕获；其次，微滴系统的多重包封（multiplet）会导致条形码冲突或假配对，需在下游生信中严格过滤；再次，单细胞建库成本显著高于bulk方法，且对细胞活性与处理时间要求高（影响捕获效率）。此外，单细胞方法通常捕获的是转录产物（mRNA），并不能直接反映膜表面表达或功能活性，因此常需结合功能学实验（如tetramer染色或体外刺激）进行验证。

Sanger与NGS的选择

若研究目标是对少量克隆进行高可信度的配对与后续功能学/结构学分析（例如为某一病人筛选出候选治疗TCR并进行克隆验证），一代Sanger方法仍是可靠选择。相反，当研究目标是探索克隆与细胞状态的全局关系（例如在肿瘤浸润T细胞中寻找耗竭克隆与其转录谱的联系），高通量NGS单细胞方案是更合适的路径。实际项目中，许多研究采用“先bulk筛选高丰度克隆，再在单细胞Sanger测序进行配对与功能验证”的混合策略，以兼顾广度与深度、效率与可信度。

结论与展望

TCR-seq技术已从单一的克隆鉴定工具演进为可同时支持群体深度剖析与单细胞层面多组学整合的成熟平台。未来的发展方向主要集中在以下几方面：首先，长读长测序（PacBio、Nanopore）有望在不借助片段拼接的情况下直接恢复完整V(D)J序列并减少注释不确定性，尤其对复杂CDR3与同源基因家族有天然优势；其次，单细胞技术将进一步与空间转录组学、蛋白质组学（如CITE-seq）与原位测序结合，以同时保留克隆信息、细胞状态及其空间分布；再次，机器学习与大规模数据库（VDJdb、McPAS-TCR等）的融合可以提高基于序列的表位预测能力，但该方向仍需大量实验验证以避免“过拟合”与错误推断；最后，标准化、参考材料与开放数据将是推动临床级别应用（如免疫监测或作为疗效生物标志物）的关键。

对于研究团队与工业用户，建议根据研究目标权衡选择：若目标是大样本量的群体学比较或长期克隆追踪，bulk（含UMI与校正）是高性价比方案；若目标需配对信息或将克隆与细胞功能直接关联，则应采用单细胞V(D)J方案并预留功能验证流程。