摘要:本文主要对测序中经常遇到的问题进行总结并提出解决方法,同时对测序样品的要求作出分析,帮助我们在测序前对样品做好准备,并在失败的结果中找到解决方法。
测序信号衰减或中断是测序过程中的常见问题,原因多种多样:模板中含有重复序列,或是模板含有高级结构所致,模板中GC含量过高等都有可能使测序信号衰减,此外,引物的质量,试剂失活也有可能造成此现象。解决方法:采用反向引物测序,通过序列拼接获得全长,过程中可适当的加入DMSO,并使用高级试剂盒扩增。
测序中间出现重叠峰(双峰),是因为序列前面有连续的碱基出现,或是测序引物碱基缺失。如果一直出现重叠峰,就是序列本身有非特异性条带,非特异性条带的话就要从PCR扩增开始分析,注意提高PCR扩增的特异性,扩增可以选择高特异性的Taq酶(如热启动酶),能够大大的降低错配,提高扩增序列的特异性。也可以做TA克隆,采用单克隆测序。测序的引物,最好自己提供,保证引物的特异性并防止降解(不要选择通用引物),同时表明测序结果提供序列全长。
Poly(A/T/C/G)结构的测序易出现移码现象并导致测序信号衰减中断,这是因为序列中有连续的碱基出现所致,建议采用反向引物测序获得全长。
目的片段插入失败(提供的克隆为阳性克隆)或培养过程中目的片段丢失,只要重新挑取单克隆,进行PCR后送去测序即可。
测序引物要求较高,理论上可以用PCR扩增时的引物测序,但不能测得全长,当测序完成时,可以从中间设计引物反向测一个,这样便能得到序列全长。测序的引物3’端要和模板完全配对,长度16-22bp左右,GC含量50%左右,测序引物纯度有很高要求,必须经过纯化且纯度至少大于90%。
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