噬菌粒和辅助噬菌体

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噬菌粒结构

噬菌粒是一种对丝状噬菌体进行人工改造得到特殊类型的载体,兼具了丝状噬菌体与质粒的优点,由单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因等部分组成。噬菌粒具有基因组较小可插入较大片段、复制型为双链DNA易于操作、转化效率高、产生的重组子更加稳定等优点。
噬菌粒结构

图1:噬菌粒结构

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噬菌粒的原件及其特点

衣壳蛋白

丝状噬菌体有pⅢ、pⅧ、pⅥ、pⅨ五种衣壳蛋白,这五种蛋白都可以用来进行多肽的展示,但最常用的是pⅢ和pⅧ蛋白。

启动子

启动子是表达载体的核心元件,噬菌粒载体最常用的启动子有乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子和T7启动子。

信号肽

噬菌粒载体信号肽通常选择Sec-识别信号或SRP-识别信号肽。研究表明,Sec-识别信号肽适合展示分泌蛋白,如抗体;SRP-识别信号肽适合转运折叠比较迅速的蛋白,如锚定蛋白。

基因间隔区(IG region)

基因间隔是DNA的一个片段,不属于编码区。在噬菌粒进入宿主细胞质后,IG区的单链DNA复制起始位点(噬菌体ori区域)会被PⅡ蛋白识别进而引发单链DNA的生成。

噬菌粒生命周期

噬菌粒作为一种特殊的质粒,可以像一般的质粒那样被复制,也可以在病毒体内作为单链DNA被包装。

噬菌粒的生命周期通常为:将外源基因以双链形式定向整合至噬菌粒,然后通过化学转化或电转等方式转入宿主细胞。由于噬菌粒中除了PⅢ蛋白基因以及欲在噬菌体上展示的外源基因外,没有任何噬菌体功能基因,导致噬菌粒不能独立合成单链DNA,因此,需要在辅助噬菌体的帮助下才可以完成对宿主细胞的侵染。

在没有辅助噬菌体超染时,噬菌粒像质粒一样进行扩增;宿主经辅助噬菌体超感染后,在辅助噬菌体的作用下,噬菌粒IG区的正链复制起始位点产生ssDNA,随后噬菌粒的ssDNA与pⅠ、pⅣ、pⅪ和宿主细胞的硫氧还原蛋白完成复杂的组装过程,含有噬菌粒基因组的噬菌体成熟。成熟的噬菌体由细胞质释放到外部环境中。至此噬菌粒的生命周期完成。

辅助噬菌体

辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型。其基因组具有M13噬菌体的所有功能基因,但IG区是缺陷的,不能被pⅡ蛋白识别,因而辅助噬菌体本身DNA不能进行单链复制。辅助噬菌体能为噬菌粒提供pⅡ蛋白和包装蛋白,在辅助噬菌体的帮助下,噬菌粒可以顺利的进行DNA的复制与噬菌体的包装,完成对宿主的侵染(这一过程通常称为超染)。常用的辅助噬菌体有VCSM13和M13K07等。

辅助噬菌体的工作原理为:当含有重组基因的噬菌粒转染至大肠杆菌后,再用辅助噬菌体进行超染,辅助噬菌体合成的pⅡ蛋白就会优先识别噬菌粒上的正常基因间隔区(IG region),启动滚环复制,产生ssDNA,这样所产生的子代噬菌体外壳蛋白所包装的ssDNA主要是来自含有重组基因组的噬菌粒的DNA,并同时展示噬菌粒编码的pⅢ或pⅧ与外源肽段的融合蛋白和辅助噬菌体编码的野生型pⅢ或pⅧ蛋白,确保重组噬菌体能正常感染组装和增值。
辅助噬菌体工作原理

图2:辅助噬菌体原理解析

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