TMB底物液的主要成分是3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB)),是辣根过氧化物酶(HRP)的底物,在辣根过氧化物酶的作用下,发生氧化反应生成蓝色产物,颜色的强弱与HRP的活性呈正比,从而可以用于基于HRP标记物的检测。
根据使用计划,将需要的TMB显色液从大瓶转移至干净的避光小瓶中,后续从小瓶中取用。
加液:加完HRP结合物并温育一定时间后,洗板3-5次,每孔加TMB显色液100ul-200ul。根据实验需要,在室温(15-25°C)或37°C下温育10-30分钟。
终止:加50微升终止液(1M盐酸或硫酸溶液)终止反应,孔中反应液由蓝色变为黄色。
读数:终止反应后30分钟内在450nm处读数。
注意:如果出现高的反应背景或沉淀,表明TMB底物反应过于强烈。为了避免产生沉淀,可在终止后马上读数,或者进一步稀释一抗或HRP结合物。
常温运输(勿超过30°C),2-8°C避光储存12个月。
1.适用于HRP标记的ELISA实验,该底物中含TMB和过氧化氢,在HRP的作用下,被氧化形成水溶性蓝色产物,在370 nm和650 nm有吸收峰。进行动力学实验时,可直接检测650 nm的吸光度。由于蓝色会不断加深,推荐及时加入终止液,加入酸性终止液后溶液变成稳定的黄色,检测波长为450 nm,吸光度值可较不终止增加数倍且保持稳定。
2.该底物对微量的HRP酶敏感,在使用过程中应避免污染,切忌将枪头直接插入大瓶中取液。一旦未使用的显色液变蓝了,说明试剂遭到污染,需停止使用。
3.操作过程中避免阳光的直射,分装的容器建议用塑料容器,避免使用金属容器以及细菌和氧化还原剂污染的容器。
4.大量分装时最好使用称重的方法或蠕动泵。
5.过高浓度的HRP会导致TMB呈现绿色或红色,或终止后出现沉淀,应该减少抗体和标记物的用量或缩短孵育时间。
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