稳定细胞系构建

德泰生物提供哺乳动物稳定细胞系构建服务,与瞬时转染不同,稳定细胞系构建是指外源基因进入受体细胞并整合到细胞的染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因,稳定细胞株表达的蛋白/抗体稳定性更好和批次差异性更小。

稳转细胞株筛选

我们的稳转细胞株筛选培养的是CHO细胞,针对我们自主研发的高表达proEM系统定向驯化的pro-CHO细胞,在重组蛋白生产过程中表现出很高的产能和细胞密度。pro-CHO还可以根据客户特殊的培养基成分进行驯化。pro-CHO展示卓越的生长代谢特征,不管是在摇瓶,还是在wave或细胞罐中,其强劲的生长曲线为蛋白高产奠定了坚实的基础。

项目 服务内容 稳定细胞系
构建周期
最终交付 价格
基因合成&亚克隆 密码子优化&基因合成 ~4周 表达载体;
测序报告;
1株稳转细胞株(2管/株,1×107cells/ml);
询价
载体构建&质粒制备
细胞转染 细胞转染 ~4周
表达检测(WB或ELISA)
稳定细胞系构建 压力筛选 ~2月
稳转细胞株筛选
蛋白生产
细胞冻存

稳定细胞系构建 流程图:

稳定细胞系构建

我们的优势

  • 最新技术双压力proEM系统,全面提升高表达稳定细胞系建立成功率。
  • 严谨的细胞来源:细胞来源可追溯,商品化的培养基。
  • 宽广的表达对象:重组单抗、蛋白、抗体或蛋白片段
  • 稳定高产:重组单抗可达2g/L,2-4×107cell/ml
  • 周期短:从DNA到细胞株只需要3-4个月
  • 全程技术支持

稳定细胞系构建原理与方法

查看全文:稳转株筛选原理方法

利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种:瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染,外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少,能够满足小量蛋白制备,大量生产成本很高。相对于此,稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达,同时经过抗生素加压筛选,最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株,稳转株生产蛋白稳定性更好,批次差异性更小。


稳定细胞系构建

如图,目的基因(红)转染至宿主细胞,通过一定的细胞转染方法,可以获得两种结果。结果A:目的基因整合到了宿主自身的基因组上,此为稳定转染,随着细胞的生长复制,目的基因能够稳定存在并表达,因此稳定转染的细胞可以成功构建并筛选稳转细胞株。

B是目的基因被转染到了宿主菌内,但是未整合到宿主自身基因组上,此为瞬时转染,目的基因只能短期快速表达,随着细胞的不断生长分裂,目的基因最终丢失。


细胞转染方法比较

细胞转染方法 细胞转染原理 主要特点 主要特点
阳离子脂质体转染法 带正电荷的脂质体靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物,然后通过细胞的内吞作用进入细胞 a)操作简便
b)适用于各种裸露的DNA和RNA片段
c)适合转染各种的细胞
d)对DNA浓度有一定要求
e)对细胞有一定的毒性
瞬时转染
稳定转染
所有细胞
磷酸钙法 磷酸钙能够促进外源DNA和细胞的结合,磷酸钙-DNA复合物能够附着到细胞表面,并通过内吞作用进入细胞 a)操作简单
b)对DNA浓度要求高
c)适用性有局限(不适用于原代细胞)
瞬时转染
稳定转染
电穿孔法 高脉冲的电压破坏细胞膜,在细胞膜表面形成孔道,DNA通过孔道进入细胞 a)适用性广,适用于质粒和几十kb的基因组片段
b)针对不同细胞要优化实验条件
c)细胞致死率较高
瞬时转染
稳定转染
所有细胞

稳转细胞株筛选流程

细胞复苏

细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复,防止在解冻过程中,产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下:

  • 预先加热水浴锅,温度至37-40℃,并在离心管中准备好10ml培养基;
  • 从液氮罐或冰箱中取出细胞,迅速放进预热的水浴锅中,镊子夹住冻存管晃动,使其受热均匀;
  • 当冻存管内完全融化时,注意用酒精擦拭冻存管消毒,将液体倒入含有10ml培养基的离心管中;
  • 离心5min,去除上清,得到沉淀;
  • 用培养基悬浮沉淀,并接种到培养瓶常规培养。

细胞复苏后,生长一段时间,95%的细胞贴壁生长,细胞状态良好,说明细胞复苏成功。

细胞转染

以脂质体转染为例的操作流程。

  • 将复苏后常规培养的细胞按照1-3×10^5接种到6孔板中,加入2-4ml的完全培养基,混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜;
  • 无菌状态下配置如下溶液:a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒; b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂(血清的存在会影响转染效率,因此要使用无血清培养基转染)
  • 将ab溶液混合并摇匀,室温下放置30min左右;
  • 细胞培养至80%单层左右,用无血清培养基洗涤细胞2次,每孔加入1ml的无血清培养基,并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向轻摇混匀,二氧化碳培养箱中37℃培养24小时;
  • 将转染液倒出,换为完全培养基继续培养。

稳转株筛选

24-72h加入选择性抗生素进行稳转株筛选,预实验确定抗生素的最佳浓度,确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度。

查看全文:稳转细胞株筛选实验流程

询价与订购

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