原核蛋白表达服务

德泰生物拥有超十年的蛋白表达经验,已成功交付2000+组蛋白,包括毒性蛋白、生长因子、酶等。主要应用于:作为抗原制备抗体;参与细胞实验与动物实验;测定蛋白酶活;研究蛋白相互作用(免疫共沉淀,GST pull down);蛋白结晶结构研究,免疫组化实验等,不同的应用对于蛋白的要求也互不相同。在进行蛋白表达时,通常要考虑以下几点:

  • 蛋白本身特性:蛋白的分子量大小,蛋白来源/物种,是否为毒性蛋白,蛋白翻译后修饰程度,蛋白结构复杂程度,在细胞内外的定位等;
  • 蛋白表达系统选择:不同蛋白表达系统有不同的优势,如表达量高低,能否糖基化修饰等,结合蛋白应用并全面考虑,选择最合适的蛋白表达系统;
  • 蛋白需求量:不同下游应用需求量有所区别,制备抗体需2~8mg,常规功能学研究10~200ug,细胞实验或药物研究则需更多;
  • 蛋白纯化标签去留:蛋白纯化标签主要有His,GST,SUMO,MBP等。His标签只有0.84kd,利于纯化且对蛋白无影响,可以保留;其他属于大标签,可以提高蛋白可溶性,但需要切除,否则会影响蛋白结构功能。
服务内容 服务内容 德泰交付 周期 价格
原核蛋白表达 保证型服务
承诺不成功,不收费
  • 表达载体/表达菌株;
  • 3-5mg,>90%纯度蛋白
  • 质检报告
  • 项目流程报告
4~6周 询价
内毒素去除服务
(可选)
包括制备过程中内毒素控制及纯化过程中内毒素去除两部分,内毒素水平控制在0.01~1.0 EU/ug
  • 内毒素质检报告
1~2周
大规模发酵服务
(可选)
利用发酵工艺,提供毫克至克级重组蛋白制备,满足大量制备的需求
  • 最终交付客户需求的蛋白量(或菌泥)
  • 2~5周

    实验流程

    实验流程 服务特色 周期
    密码子优化 自主研发MaxCodonTM生物信息学软件,对稀有密码子、密码子偏好性等因素进行分析优化(什么是密码子优化? ~2周
    基因合成&载体构建 德泰拥有几十种表达载体:pET系列(pET28a、pET30a、pET43.1 a等),pGEX4T-1、pBAD24、pGADT7、pQE-30等
    表达小试 根据蛋白的性质选择合适的菌株:BL21 (DE3) 、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21 CodonPlus(DE3)、codon Plus(DE3)、ESL等
    多种表达条件优化,增加可溶性蛋白表达量
    1周
    放大表达&蛋白纯化 放大表达&纯化,交付您需要的蛋白量
    四大蛋白纯化方法,先进的AKTA纯化设备,可纯化标签/无标签蛋白
    2~4周
    蛋白质检 SDS-PAGE、WB检测、质谱检测(可选)

    原核表达案例

    案例为蛋白酶A的制备,该蛋白的制备难点在于:
    a. 该蛋白酶自身含有酶切位点,表达很难获得目的蛋白,在前段加入一段非信号肽的前肽,可以抑制蛋白酶A的活性,再通过快速纯化获得;
    b. 在纯化过程中需要对该段前肽进行切除,需要低温快速纯化,难度较大;
    c. 切除后的蛋白不含有标签,不能用标签亲和纯化,需要利用磁珠对目的蛋白进行纯化。

    制备流程

    蛋白表达:目的蛋白很难直接表达出来,通过在蛋白序列前段加入一段非信号肽的前肽,使目的蛋白成功表达;
    蛋白纯化:采用胰凝乳蛋白酶对加入的前肽进行切除。实验人员对酶切条件进行了多次摸索,包括酶切的时间、胰凝乳蛋白酶浓度、是否需要加抑制剂、抑制剂浓度及抑制时间等(全程共用凝胶34块)。最终找到了合适的酶切条件成功将前肽切除掉。自制磁珠亲和纯化柱,验证可用后利用磁珠亲和纯化柱纯化得到目的蛋白。

    蛋白酶A纯化电泳图

    Lane M:SDS-PAGE Protein marker
    Lane 1:酶切前
    Lane 2:酶切后不加抑制剂
    Lane 3:酶切后+抑制剂(TPCK)
    Lane 4:与NHS磁珠孵育后FT
    Lane 5-6:洗杂
    Lane 7-10:洗脱目标蛋白

    图1:纯化得到目的蛋白

    对目的蛋白进行活性验证。利用蛋白酶A对相应底物进行酶切,结果如下图。经验证,制备的蛋白酶A具有酶活性。

    经验证,制备的蛋白酶A具有酶活性

    Lane M:SDS-PAGE Protein marker
    Lane 1:底物(2.0ug)
    Lane 2:蛋白酶A/底物=10/1
    Lane 3:蛋白酶A/底物=20/1
    Lane 4:蛋白酶A/底物=50/1
    Lane 5:蛋白酶A/底物=100/1
    Lane 6:蛋白酶A/底物=200/1

    图2:验证蛋白酶A的活性

    原核表达系统

    原核表达系统是通过原核生物来获得外源蛋白的体系。原核表达是目前常用的重组蛋白表达方式之一,操作相对简便,要求较低。相对哺乳动物表达系统更加经济节约。但是也常常遇到一些问题,比如原核表达蛋白表达量低?蛋白不表达?蛋白表达不在上清易形成包涵体等情况,本文主要根据实验经验总结原核蛋白表达的两个问题蛋白为什么不表达和蛋白表达为什么不在上清,并提出针对性的解决方案,帮助我们提高实验的成功率。

    蛋白表达为什么不在上清?

    大肠杆菌的表达部位通常在细胞质中,细胞周质中,细胞外。
    周质中表达的蛋白质,分离纯化简单,而且周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠,但是蛋白产量很低
    胞内表达是外源蛋白在大肠杆菌中主要的表达形式,但是由于大肠杆菌的细胞质环境呈现还原性,不利于蛋白二硫键的形成和稳定,从而导致蛋白的不准确折叠,形成不溶性的包涵体… 更多

    如何提高蛋白可溶性?

    可溶性策略
    • 选择合适的宿主细胞
    • 采用融合标签表达
    • 选择合适的质粒载体
    • 分泌型表达
    • 优化培养条件

    更多原核表达系统内容

    订购流程

    请您联系我们/在线咨询/填写《 蛋白表达服务定制表》并发送到邮箱Sales@DetaiBio.com,我们将为您设计最佳方案。

    仅供科研

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