上清表达优化服务

原核蛋白上清表达优化型服务

南京德泰生物的上清蛋白表达服务是我们原核蛋白表达服务的高级服务项目,我们专业的技术团队通过优化不同的表达条件,使上清中蛋白的表达量增加。在上清中表达的蛋白直接处于可溶状态,不需经过蛋白复性,因此更接近蛋白的天然结构,在下游的实验应用中有更好的表现。南京德泰生物凭借特有的基因序列优化技术,载体优化技术以及丰富的表达条件优化筛选经验等多种技术硬实力来确保实现上清蛋白的高表达。
对于上清表达量低,蛋白复性后没办法正确折叠或对上清蛋白有特殊需求的客户,德泰原核上清表达优化型服务是非常值得信赖的选择。

服务内容

客户提供 实验周期 交付
提供序列 6~8周
  • 表达载体/表达菌株;
  • 项目报告及COA;
  • 蛋白/条件优化报告;

附:实验报告可以包括表达载体优化报告、表达条件优化报告、蛋白质可溶性及得率评估报告等。

服务流程

德泰蛋白表达上清优化型服务流程
A)密码子优化与基因合成:德泰自主研发的MaxCodon™密码子优化软件,有效提升蛋白表达水平。
B)质粒的选择与亚克隆:选择合适的质粒,并将目的基因亚克隆至载体上
C)菌株的选择与转化:选择合适的菌株,并将带有目的基因的质粒转化至菌株内
D)蛋白表达与表达条件优化:从表达温度,诱导剂浓度,培养基种类等多个方面进行48种表达条件的优化
E)离心并进行上清分析:取细胞液进行破碎,离心并进行上清分析
F)选出最适合的表达条件
G)提交项目报告
H)扩大培养(可选)

优化项目

优化项 优化原理 优化内容
密码子优化 密码子的简并性 优化内容包括:
稀有密码子优化
mRNA结构优化
tRNA浓度优化
载体优化 根据蛋白选择合适的质粒,增加可溶性蛋白表达量 pET系列:pET30a,pET28a
pCold载体(用于低温表达)
其它内部构建载体
表达菌株优化 根据蛋白性质选择合适表达菌株,增加蛋白表达量及可溶性表达量 增加mRNA稳定性:BL21 Star (DE3) 菌株
促进二硫键的形成以及蛋白的折叠:OrigamiB(DE3)菌株
蛋白序列中含有稀有密码子:Rosetta(DE3)菌株、BL21 CodonPlus(DE3)菌株
其它菌株
内含子含量 高浓度的内含子对于细胞有潜在毒性,并且更易形成包涵体 降低内含子溶度
融合标签选择 融合标签可以增加蛋白的可溶性表达,超过70%的蛋白质测试显示,可溶性表达高的蛋白中至少结合两个融合标签 选用的融合标签有:
GST、MBP、NusA、Trx
表达条件优化 选择有利于蛋白可溶性表达的条件,增加蛋白可溶性表达 48种表达条件优化,选出最适合的表达条件
分子伴侣 分子伴侣的功能是可提高蛋白的可溶,促进蛋白的正确折叠 常用的分子伴侣有:
GroES-GroEL
DnaK-DnaJ-GrpE

Tips:  48种优化条件由3个载体条件、4个感受态条件、3种诱导剂浓度条件、3种温度条件以及2种时间条件组合而成(不同蛋白性能不同,各个条件数量稍有区别)。

案例分析

案例中的蛋白为正常情况下表达量极低的蛋白(上清中纯化后得不到目的蛋白)。对该蛋白进行温度、诱导剂溶度、诱导时间、表达菌株选择等表达条件的优化。实验结果如下图:

德泰蛋白表达上清优化型服务案例电泳图
图1. 蛋白不同表达优化条件下的上清液电泳图
德泰蛋白表达上清优化型服务案例纯化图
图2.优化后的上清蛋白纯化电泳图
图片15

该蛋白在进行表达条件优化后,得率提升了2-3倍。
在进行表达条件优化后,目标蛋白在上清中的表达量有了显著的增加。

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