酶解法与表达系统制备Fab流程简述

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酶解法制备Fab

利用木瓜蛋白酶生产Fab片段

  • 取实验室自制的抗体或IgG粉末置于0.01mol/L的PBS(ph=7.4)中透析3h,调整抗体浓度1mg/mg。
  • 将木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液(0.1mol/L PBS,ph=7.4,其中加入0.2mol/L EDTA和0.01mol/L半胱氨酸),配置成1mg/mL的溶液。37℃活化20min。
  • 将木瓜蛋白酶与抗体溶液按1:10的比例混合,在37℃下反应6h。
  • 将反应完产物使用10kDa的超滤管在4000rmp,4℃下超滤,除去木瓜蛋白酶,同时替换溶剂为0.01mol/L的PBS(pH=7.4),溶解后的溶液即为Fab片段与Fc片段的混合物。
  • 对酶解产物进行纯化。

利用胃蛋白酶生产F(ab’)2并进一步生产Fab’片段

  • 将IgG粉末100mg,溶于2 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸缓冲液。溶液稍成白浊,30℃,保温10min
  • 取结晶胃蛋白酶1.5 mg,溶于1.5 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸缓冲液,加于步骤1的溶液中,于30℃作用16h
  • 用0.1 mol/L pH8.0 PBS透析一夜
  • 加入硫醇,使成0.1 mol/L,在室温下搅拌30min
  • 加入1 mol/L的碘乙酰胺Iodoacetamide)使成为0.1 mol/L,室温下搅拌1h
  • 用0.01 mol/L PBS 1000L透析过夜,3000r/min,离心30min,去沉淀
  • 把上清过SephadexG100 (40cm×2.0cm)以0.1 mol/L PBS洗脱
  • 以每管6mL收集,约在第8管开始,Fab’片段被洗脱
  • 测OD280nm,将Fab’管合并,浓缩、冻干
  • 如制备F(ab’)2,上述4~6步骤则可以省略

Fab片段制备(大肠杆菌表达系统)

以嵌合抗CD 20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达为例[1](下文中提到的载体与表达菌株均由该实验室自行构建)
表达载体构建

  • 利用PCR法从抗CD20ScFv表达载体上扩增VH、VL基因,经琼脂糖电泳分离纯化后,分别以限制性内切酶MluI+ApaI、MluI+StyI消化,然后重组到带有人免疫球蛋白相应CH1、CL的pYZH1、pYZL载体相应的内切酶位点中,得到重组子pYZH1cd20、pYZH1cd20。
  • 用所得的重组子转化大肠杆菌菌株,扩增培养后提取pYZLcd20、pYZH1cd20质粒,分别以限制性内切酶MluI+NheI,SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZH1cd20。
  • 琼脂糖电泳分离纯化含VL、VH的相应DNA片断,利用NheI、SpeI同裂酶的特点,将这两个片断和经MluI+SphI消化所得的pYZF载体片断连接成抗CD20Fab表达载体pYZF1cd20。

可溶性表达及分离纯化

  • 将载体pYZF1cd20转入大肠杆菌菌株,经筛选与扩大培养后,挑取阳性克隆单菌落接种5 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的2×YT培养基(蛋白胨6%,酵母膏1%,氯化钠0.5%,pH7.4),37℃,200 r/min,振荡培养6 h,至OD600=0.6;6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌株。
  • 将菌株重新悬浮于20 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的AP5培养基(每1 000 ml含酸水解酪蛋白11 g,酵母膏0.6 g,硫酸镁0.19 g,葡萄糖1.5 g,氯化铵1.07 g,氯化钾3.73 g,氯化钠1.2 g,1 mol/L三乙醇胺(pH7.4)120 ml,过滤灭菌),30℃,250 r/min,振荡培养20 h;6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌体。
  • 将菌体于-20℃冻存1 h,化冻后加1 ml细菌周质腔蛋白提取液,混匀,置于4℃轻摇1 h,12 000 r/min,4℃离心20 min,取上清。
  • 用Protein G Agrose亲和柱分离纯化Fab。

蛋白质印迹实验(Western-blot)

Fab片段制备(哺乳动物表达系统)

利用哺乳动物表达系统进行Fab片段制备的表达流程为我司内部资料。如需制备服务,请查看抗体片段制备服务页面

引用:[1] 赖增祖,熊冬生,范冬梅,彭辉,许元富,朱祯平,杨纯正等。嵌合抗CD 20 抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定[J],中国免疫学杂志,2000,16(10),522-523。

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