多聚组氨酸标签(His-tag)介绍及亲和层析原理

相关资料:His标签亲和纯化实验步骤(详细)

本文描述了多聚组氨酸标签(His-Tag)融合蛋白使用Ni-IDA/Ni-NTA进行亲和层析的基本原理,优势,以及实验操作流程。

下载

固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),简称金属螯合亲合层析,是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸,使之与金属离子发生相互作用,从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等,其中以6个组氨酸残基组合的融合标签(His-Tag)在原核蛋白表达中的应用最为显著。

His-Tag可结合在目的蛋白的C末端或N末端,形成特殊的结构,以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,所以可选择范围广,高盐,存在变性剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化,His-Tag正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

His-tag作为蛋白纯化时的首选标签,其优势在于:

  1. N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;
  2. 采用IMAC(固定化金属离子亲合层析)纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便;
  3. His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能;
  4. His-Tag非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响;His-Tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;
  5. 与其它亲和标签构建成双亲和标签,并可应用于多种表达系统;

His-Tag融合蛋白的适用范围也较广,既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化,也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白,而后者则通常纯化包涵体蛋白。

His-Tag亲和层析填料

His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白质表面的特性,使之被吸附在凝胶柱上,从而达到分离纯化蛋白的目的。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位,其中Ni-IDA螯合了三价,Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高,在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出,与目的蛋白紧密结合,从而导致分离蛋白产量偏低,产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落。

Ni-IDA和Ni-NTA结构图

IMAC在通常的情况下是比较稳定的,但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂,如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此,E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂(通常存在于细菌的细胞周质中),导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时,首先需要去除螯合剂。

Ni-NTA亲和层析实验

Ni-NTA分离带His标签的重组蛋白

  1. Ni-NTA装柱,1.6×20cm,柱床体积为10ml;
  2. 用缓冲液1平衡2~5个床体积,流速为2ml/min;
  3. 将20ml细胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45um滤膜过滤,上样,流速为1ml/min;
  4. 用缓冲液1再洗2~5个床体积,流速为2ml/min;
  5. 用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱,流速为2ml/min,收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
  6. 用纯水流洗5个柱床体积,再用20%的乙醇流洗3个柱床体积,流速为2ml/min,柱子置于低温环境中保存。

缓冲液组成:

缓冲液1

50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g,
加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液2

50mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量,水调pH后定容到1000ml。

缓冲液3

不同咪唑浓度的缓冲液B配制:

咪唑浓度 缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml)
10mM 98 2
50mM 90 10
100mM 80 20
200mM 60 40
300mM 40 60
400mM 20 80

咪唑洗脱原理

Ni柱中的氯化镍可以与有His-Tag的融合蛋白结合,也可以与咪唑进行结合,当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的
镍离子介质发生结合时,不同浓度的咪唑通过层析柱,就会将与镍配位的标签蛋白,杂蛋白等分别洗脱下来,从而得到高纯度目标蛋白。

附录:Ni-IDA和Ni-NTA的一些参数对比

名称 Ni-IDA Ni-NTA
参数 指标
基质 6%交联琼脂糖凝胶
配基 亚胺二乙酸(IDA) 次氮基三乙酸(NTA)
粒径 45~165 µm 60~169 µm
金属离子密度 40 µmol/ml 20-40 µmol/ml
载量 25-30mg蛋白/ml 15mg蛋白/ml
柱体积 1ml或5ml 1ml或5ml
柱尺寸
(内径x高度)
0.9×1.57cm(1ml柱子)
0.9×1.57cm(5ml柱子)
0.6cmx2.8cm(1ml柱子)
1.4cmx2.98cm(5ml柱子)
推荐流速 1ml/min(1ml柱子)
5ml/min(5ml柱子)
最高流速 4ml/min(1ml柱子)
10ml/min(1ml柱子)
20ml/min(5ml柱子)
40ml/min(5ml柱子)
最高耐压 0.3MPa(3bar) 0.5MPa(5bar)
避免使用的试剂 螯合剂:EDTA、EGTA、柠檬酸等 >20mM硫化试剂
>10mM DTT
螯合剂:EDTA、EGTA
阴离子去污剂
pH稳定性 PH 2-14(短期,2h);PH 3-12(长期,7天)
仅供科研

联系我们

电话:(025)5889-4959

咨询:Sales@DetaiBio.com

地址:南京市高新开发区星火路10号

德泰生物科技(南京)有限公司 Detai Biologics Co.,Ltd ©2018 All Rights Reserved

南京市高新技术开发区星火路10号 Sales@DetaiBio.com English