逆转录PCR

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逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。逆转录PCR是将RNA的逆转录(reverse transcription) 和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。逆转录PCR实验原理是,提取组织或细胞中的总RNA,以RNA为模板,利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA链为模板进行PCR扩增,从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

逆转录PCR应用

逆转录PCR的用途广泛,可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的RNA病毒,如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响,以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用RT-PCR检测分析RNA转录产物具有以下突出的优点:

  • 理论上可以检测几乎任何基因的转录产物;
  • 可以实现极为微量RNA样品(ng级别)的检测;
  • 样品耐受性好,未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测;

模板

逆转录PCR的模板是RNA,可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,都需确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

RNA提取

可以利用试剂盒从细胞(或组织)中提取得到RNA。模板RNA的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响,从细胞中分离RNA应注意尽量减少RNA酶的污染(RNA酶分布广泛,除细胞内源性RNA酶外环境中也存在大量RNA酶),在提取RNA时,应尽量创造一个无RNA酶的环境:避免RNA酶污染包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性,主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂抑制内源性RNA酶。

引物

用于反转录的引物有随机引物、通用引物(Oligo-dT)及基因特异性引物三种,下表为三种引物的介绍:

引物 适用范围
随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应
Oligo-dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA(原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴)
基因特异性引物 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况

引物最好选择Oligo-dT或基因特异性引物,随机引物会从RNA的多个位点(包括核糖体RNA)开始转录,特异性低。Oligo-dT引物同大多数真核细胞mRNA3’端的poly(A)尾杂交,与使用随机引物相比特异性高。但是Oligo-dT引物对RNA样品的质量要求较高,对于从福尔马林固定的组织中提取的劣质RNA不适合用Oligo-dT引物。

逆转录酶

逆转录酶是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。RT-PCR实验中的逆转录酶需要具有以下二种活性:

  1. 依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA的第一条链
  2. 依赖DNA的DNA聚合酶活性:以一条DNA链为模板合成互补的双链DNA

在选择逆转录酶时,建议选择无RNaseH 活性(RNaseH-)的逆转录酶。具有RNaseH活性的逆转录酶的RNaseH活性会与聚合酶活性竞争RNA模板与DNA引物(或cDNA延伸链)形成的杂合链,并降解杂合链中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量与长度。

实验流程

从细胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系中→退火,引物与RNA链配对→延伸,逆转录酶合成互补cDNA链变性→常规PCR反应流程(变性、退火、延伸,如此多次循环)。

RT-PCR“两步法”与“一步法”

RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库(即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行,一步法完成),省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR,即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。一步法与两步法具有以下区别:

  • 一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率;
  • 两步法的优势在于中间产物cDNA,便于保存;且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应,有利于PCR条件的调整,实验重现性强;
  • 两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物,其灵敏度比一步法高;
  • 两步法包括第一链cDNA合成和随后的PCR反应,容易产生污染问题;
  • 两步法的实验预算要低于一步法。

RT-PCR两步法与一步法比较

图2:“一步法”与“两步法”比较

实验操作注意事项

  • RNA提取一定要迅速,样本要新鲜,组织尽量在液氮中研磨;
  • RNA提取完马上进行逆转录不要拖延,新提的RNA很容易降解;
  • 逆转录反应过程,需建立无RNAase环境,以避免模板RNA降解;

注:

① RNase是RNA水解酶的统称,包含RNase A,RNase H等,RNase A可以水解单双链RNA,RNase H主要水解RNA与DNA杂交双链中的RNA

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参考文献

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