RACE技术

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RACE即cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends),是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5′端及3′端的技术,由Frohman等人于1988年发明。利用RACE可以通过已知的部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5′和3′端。RACE的特点是在仅已知单侧序列可供设计特异性引物时,应用RACE技术仍能完成扩增,因此RACE技术也成为单侧PCR。

RACE原理

RACE包括3′RACE和5′RACE,分别用于cDNA3′端和5′端的扩增。根据已知序列设计特异性引物,利用3′RACE获得3′端序列(基因特异性引物→3′末端),利用5′RACE获得5′端序列(基因特异性引物→5′末端),最终获得完整的cDNA序列。3′RACE与5′RACE原理有所不同,下面分别做一介绍。

3′RACE

RACE的实验样本包括总RNA,poly(A)+RNA等。首先根据mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA链。根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)合成第二条cDNA链。随后以基因特异性引物(GSP)及正义链3′末端引物作为一对引物,对得到的cDNA链进行PCR扩增,从而得到cDNA的3′端序列(基因特异性引物→3′末端)。

3′RACE-PCR原理5′ RACE-PCR原理

图1:3′RACE扩增流程图2:5′RACE扩增流程

5′RACE

根据已知的cDNA序列设计基因特异引物(GSP),逆转录获得第一条cDNA链,同时用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在cDNA3′端加Poly(C)尾。依据Poly(C)尾设计特定引物合成第二条cDNA链。随后以第二条cDNA链为模板利用基因特异性引物合成双链cDNA。最后以基因特异性引物(GSP)及反义链3′末端引物为一对引物进行PCR扩增获得cDNA5′端序列(基因特异性引物→5′末端)。

在实际操作中,为了提高结果的特异性实际操作步骤会比上述原理复杂,此处只做原理性讲解,具体提高特异性的方法下文会有描述。

RACE的意义

由于某些mRNA模板过程或模板二级结构含量过高,仅利用poly(A)尾来获得全长cDNA比较困难,甚至无法实现。因为长的mRNA(或二级结构含量过高)的反转录过程往往会提前终止,导致合成的cDNA第一链不完整,最终产生大量的非特异性产物。同时实验操作繁琐,在RACE技术出现之前,获得mRNA的全长反转录物cDNA往往需要数周甚至数月才可以完成。RACE技术为cDNA克隆方法开辟了新纪元,使用RACE技术可在1-2天内获得cDNA全长序列,同时特异性大大提高。

RACE技术的优点

RACE技术相对于其它克隆全长cDNA的方法(如转座子标签技术、图谱克隆技术、mRNA差异显示技术等)具有价廉、简单和快速等特点。用RACE获得cDNA克隆只需几天的时间,而且对低丰度的起始反应物质,也能迅速反馈是否有目的产物生成。RACE所使用的起始总RNA或mRNA仅需ng级别,可扩增出丰度低于0.00001%的RNA样本,甚至仅有几个RNA分子亦可被检测出来。

RACE技术的局限性

尽管RACE的方法很有实用价值,但是要成功的应用该技术还是比较困难的,尤其是5′RACE,反转录、加尾、PCR这三个连续的酶促反应任一步骤的操作失误都会引起实验的失败,即使酶促反应步骤能顺利进行,也有可能会产生大量的非特异性产物。要做好RACE实验并不容易,实际操作中存在不少困难,需要采取多种措施以提高产物的特异性。

RACE提高特异性方法

传统RACE技术存在诸多缺点,其特异性低,产物可能是单一产物、多个产物,甚至是不能分辨的连续条带。为了提高扩增的特异性,需要在传统RACE技术基础上进行改进。RACE技术的改进主要涉及引物的设计及PCR技术的改进两部分。

引物设计的改进

  • 使用锁定引物(lock docking primer):在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸MN(结构为5′-oligo(dT)16-30MN-3′,M=A/G/C;N=A/T/C/G)。使用锁定引物可使引物定位在poly(A)起始位点,消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位结合所带来的影响。
  • 3′RACE以3′末端的poly(A)序列设计逆转录引物时,使用oligo(dT)和一段接头序列作为引物(图1),这样就在cDNA末端接上了一段特殊的接头序列,在得到第一条cDNA链之后,依据接头序列设计基因特异性引物,如此则后续的PCR扩增中一对引物均为基因特异性引物,可以有效提高扩增的特异性。
  • 5′RACE在以第一条cDNA链3′末端的poly(C)计扩增引物时,使用poly(G)和一段接头序列作为引物(图2),在第二条cDNA链后接入一段特殊的接头序列。依据接头序列设计基因特异性引物,并用此引物与根据已知cDNA序列设计的基因特异性引物作为一对引物进行PCR扩增。

PCR技术的改进

  • 提高反转录的温度:mRNA反转录成首链cDNA决定了5′RACE的成败,由于靠近mRNA的5′端GC/AU比率较高,可能形成稳定的二级结构从而导致在反转录时产生切短的cDNA片段。这些片段不但可以与完整的cDNA片段进行同样的加尾反应,而且在后面的PCR中还会被优先扩增,从而产生大量的的非特异性产物。因此,可以采用提高逆转录温度的方式降低反转录过程中mRNA二级结构的稳定性。
  • 采用巢式PCR:巢式PCR是指使用两对或两对以上的引物进行DNA扩增的技术,即先设计一对特异性引物(GSP1、GSP2)进行第一轮扩增,随后使用在第一对引物内部的第二对特异性基因(GSP3、GSP4)进行第二轮扩增(根据需要也可设计第三对引物GSP5、GSP6,进行第三轮扩增)。利用巢式PCR可提高PCR扩增的特异性。

常见的RACE技术

随着分子生物学技术的发展,科学家结合其它的分子生物学技术对最初的RACE技术进行了改进,从而丰富了RACR技术的类型。目前使用的RACE技术包括:经典RACE、Adapter-Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE和环形RACE等等。

Adapter-Ligated RACE

Adapter-Ligated RACE是Adapter-Ligated PCR技术与RACE技术的结合。利用T4连接酶将接头与cDNA两末端连接,在PCR循环的退火步骤中,由于短cDNA退火温度低,两端接头容易发生退火,形成锅柄状结构,两端接头结合阻止引物与模板结合,终止PCR反应。长cDNA的退火温度高,不易形成锅柄结构,因此引物可以与接头结合,实现延伸。Adapter-Ligated RACE可以让长片段cDNA的克隆在扩增反应中占主导,从而尽可能多地得到目的基因的序列信息。

RLM-RACE

利用断裂的mRNA5′端没有帽子结构的特点,事先加入牛小肠碱性磷酸酶(CAP)将断裂mRNA5′末端暴露的磷酸基团切除。再加入烟草酸焦磷酸酶(TAP),TAP具有切除mRNA帽子结构的催化活性,能够使mRNA5′端暴露一个磷酸基团,接着在T4连接酶的催化下将衔接头与经过活化的mRNA5′端链接。经过钝化的mRNA是不能与衔接头链接的。经过这样处理后,便可以扩增目的mRNA5′端片段。

Cap-switching RACE

第一步以poly(T)作为引物对mRNA3′端克隆。当新和成cDNA延伸到mRNA5′帽子结构时,加入莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)在cDNA3′端加入若干胞嘧啶poly(C)。MMLV所催化的加尾反应需要依赖模板和帽子结构的存在,因此只有完整的cDNA末端才会加上胞嘧啶残基,接着加入特异性引物,该引物在3′末端含有含有多聚鸟嘌呤核苷酸poly(G)可与cDNA末端新添加的多聚胞嘧啶核苷酸poly(C)退火,在DNA聚合酶的催化下以新添加的引物为模板实现接头转化,从而向cDNA3′端引入特异性序列,最后再进行PCR。

环形RACE

环形RAC利用poly(T)引物进行逆转录PCR反应扩增第一条cDNA。经RNaseH降解模板后加入T4链接酶,加入T4连接酶时会发生环化反应或串联反应。无论是环化反应或是串联反应的产物都可以根据已知序列设计新引物来补充第二条链。环状分子或串联分子产生第二条cDNA链后,在未知区域的两侧设计一对引物将未知区域置换到已知序列中间,进行普通PCR。

需要说明的是,RACE技术种类繁多,但目前没有任何一种RACE技术能完美地扩增多有类型的RNA,每一种RACE技术都有其适合扩增的RNA种类,比如经典RACE适合扩增有poly(A)尾结构的RNA,Cap-switching RACE技术适合于扩增具有5′端帽子结构的RNA。

RACE与抗体测序

将RACE扩增得到的cDNA片段克隆至载体中,使用仪器对克隆后的质粒进行测序,最终得到该cDNA的序列。德泰生物提供杂交瘤细胞测序服务,可对抗体的可变区、重链、轻链及全长进行测序。

更多阅读

荧光定量PCR
降落PCR

参考文献

[1]. 徐烨,刘雅婷等.几种主要的RACE技术及应用[J].中国农业科技导报,2012,14(2):81-78;

[2]. 邓雪柯,殷建华等.3中5′RACE技术的比较与优化[J].成都医学院院报,2007,2,1:20-23;

[3]. 陈启龙.RACE技术的研究进展及其应用[J].2006,6,3:95-98;

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