巢式PCR

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常规PCR在对模板进行扩增的过程中,引物与模板之间会出现非特异性配对,导致产生非特异性产物。为了提高PCR扩增的特异性,人们对常规PCR进行技术改良,发明了巢式PCR(nested PCR)。

巢式PCR是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增,第二轮的扩增产物才是目的基因片段。巢式PCR的实验原理为根据DNA模板序列设计两对引物,利用第一对引物(称为外引物)对靶DNA进行15-30个循环的标准扩增(见图1);第一轮扩增结束后将一小部分起始扩增产物稀释100-1000倍加入到第二轮扩增体系中作为模板,利用第二对引物(称为内引物或巢式引物,结合在第一轮PCR产物的内部)进行15-30个循环的扩增(见图1),第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。

巢式PCR原理

图1:巢式PCR扩增流程

与常规PCR技术相比,两套引物的使用提高了扩增的特异性,因为和两套引物都互补的靶序列很少。如果第一次扩增产生了错误片段,内引物与错误片段配对扩增的概率极低,因此提高了PCR扩增反应的特异性与灵敏度。

巢式PCR特点

  • 克服了单次扩增平台期效应的限制,使扩增倍数提高,从而极大的提高了PCR的敏感性;
  • 由于模板和引物的改变,降低了非特异性反应连续放大进行的可能性,保证了反应的特异性;
  • 内测引物扩增的模板是外侧扩增的产物,第二阶段反应能否进行,也是对第一阶段反应正确性的鉴定,因此可以保证整个反应的准确性及可行性。

注意事项

巢式PCR的注意事项与常规PCR基本相同。除此之外,巢式PCR实验还需要注意两轮扩增引物的比例:如果第一次引物过量的话,剩余引物第二次PCR扩增的时候同样能有一定的产量,这对于第二次PCR反应而言就是非特异性的产物。在第一次PCR时,应尽量摸索引物最低的加入量,同时适当增加循环次数,尽量消耗体系中的残余引物。

常见的巢式PCR技术

除了常规巢式PCR外,巢式PCR还有多种形式的扩展,下面分别做一介绍:

半巢式PCR

巢式PCR是利用第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板,除使用第一轮的一对特异引物之外,在第二轮PCR反应中使用一对新的特异引物,共使用四条特异性引物进行DNA扩增。半巢式PCR与巢式PCR原理相同,只是在第二轮PCR反应中使用的引物有一条为第一轮PCR的引物,这种利用三条引物进行两次PCR扩增的方法称为半巢式PCR( semi-nested PCR)。

在一些需要利用巢式PCR进行扩增的实验中,如果基因的3’末端或者5’末端无法设计出两条引物,可以使用半巢式PCR。

反转录巢式pcr

反转录巢式PCR( RT-nested PCR)是在反转录PCR的基础上发展起来的,在通过反转录获得cDNA的基础上,对目的基因进行巢式PCR扩增。它和简单的反转录PCR一样是用于检测某种RNA是否被表达或者比较其相对表达水平,但是特异性更高、可靠性更强,可用于拷贝数较低的RNA的扩增,例如扩增丙型肝炎病毒(HCV)感染者体内的HCV基因。

单管巢式PCR

单管巢式PCR是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计,巢式外侧两个引物为25bp,退火温度比较高(68℃);巢式内侧两个引物为17bp,退火温度较低(46℃)。通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增,经过20~30次循环后(第一轮PCR结束),再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增。单管巢式PCR两轮PCR反应均在一个PCR管中进行,减少了交叉污染的可能性。

共有序列巢式PCR

共有序列巢式PCR( consensus nested PCR),又称为共有引物巢式PCR( consensus primer nested PCR),根据同一种属内较为保守的序列设计简并引物,通常第一轮PCR引物的简并碱基较多,第二轮PCR引物的简并碱基较少一些,扩增长度为200~300bp。引物通常设计在能够区分微生物的不同亚型的区域内。对于某一种生物,例如病毒,种属内型别很多,但检测样本中的病毒型别又不确定,使用共有序列巢式PCR扩增获得目的序列,进而通过测序获得未知微生物的信息,是一种敏感而又简便易行的检测方法。

共有序列巢式PCR引物设计尤为重要,在引物设计之前要搜集可能相关的所有DNA序列,利用软件进行严格的序列对比分析,从中找出保守的序列,在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸的多样性,则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基,将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑,第二轮PCR扩增产物长度控制在200~300bp左右。由于引物中简并碱基较多,要摸索适合的退火温度。

巢式PCR应用

巢式PCR大多应用在当模板DNA含量较低时,用一次PCR难以得到满意的结果,这时用巢式PCR的两轮扩增可以得到很好的效果。

巢式PCR操作简单,所需条件与常规PCR相同,但与常规PCR相比进一步提高了反应的特异性与灵敏性,在微生物学、生物信息学、生物医学等方面有着极其广泛的应用。例如巢式PCR技术与RFLP(限制性片段长度多态性)技术结合,通过设计高度保守序列的引物对待检物种DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行RFLP分析,从而完成DNA分子水平上的多态性检测,该法常用于流行病学的调查和临床常规检测。

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参考文献

[1]程小华,杨飞等.巢式PCR检测血清样品中HCV RNA的稳定性[J].2011,32(4):526-528;

[2]黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用[M].北京:化学出版社,2011:38-51;

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