哺乳动物细胞蛋白表达实验操作

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本文主要讲述了哺乳动物细胞蛋白表达实验的操作步骤、表达流程,因哺乳动物细胞表达为统称,所以具体的实验从瞬时转染表达和稳定细胞系构建两个实验步骤入手。

随着基因工程的日益发展,重组蛋白表达技术生产的部分蛋白已逐渐被人们接受。体外重组

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蛋白表达主要系统有真核表达系统和原核表达系统,其中原核表达系统以大肠杆菌表达最为常用。而真核表达系统包括哺乳动物细胞表达和酵母表达。根据不同的实验目的,哺乳动物细胞表达又可分为瞬时转染表达和稳定细胞系构建两类实验。两类实验的步骤和方法也不相同,因此关于哺乳动物细胞表达的实验流程主要从两方面入手,下面一一介绍。

瞬时转染表达实验操作

瞬时转染表达为哺乳动物细胞生产蛋白的方式之一(具体原理介绍见:瞬时转染表达)。相对原核表达操作较为复杂,整个过程无菌,需在细胞房中进行,投入的人力物力更多。同时,根据不同的瞬时转染方法,实验操作流程又大相径庭。本文主要列举一下几种瞬时转染实验操作。

脂质体转染

脂质体转染

一.试剂配制

  1. HBS(Hepes-buffered saline)。876mg的氯化钠溶于90ml左右的去离子水中,在加入1mol/L的Hepes,调整pH至7.4,定容至100ml,过滤。
  2. 培养基,无血清的培养基,转染正常细胞的培养基。

二.实验流程

(一)表达载体的构建

  1. 这一步可交给基因合成公司进行,提供优化后的基因序列,克隆至相应的载体上;

(二)细胞转染

  1. 预实验测筛选浓度:G148筛选浓度测定,将细胞培养与24孔板中,用不同浓度的G148(100mg/L-600mg/L)加入,各浓度3个孔,同时设置正常对照组,培养12-14左右以全部细胞死亡的筛选浓度为准。
  2. 细胞转染前天开始接种细胞,至转染当天细胞生长到达70%左右的覆盖率;
  3. 细胞开始转染:

无菌状态下配置如下溶液:

  • a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒
  • b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂(血清的存在会影响细胞转染效率,因此要使用无血清培养基转染)
  • 将ab溶液混合并摇匀,室温下放置30min左右
  • 细胞培养至80%单层左右,用无血清培养基洗涤细胞2次,每孔加入1ml的无血清培养基,并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向轻摇混匀,二氧化碳培养箱中37℃培养24小时
  • 将转染液倒出,换为完全培养基继续培养,培养3-4天后检测蛋白表达量

三.注意事项

  1. 优化转染条件,包括转染质粒的纯度(高纯度),脂质体的用量及细胞的生长密度(可通过经验论或实验摸索),避免微生物的污染;
  2. 脂质体混合物的制备,在脂质体转染情况下,培养基采用无血清培养基;
  3. 脂质体和DNA的加入保持一致,边加入边混匀,避免出现局部浓度过高;

细胞系构建实验操作

细胞系构建是哺乳动物细胞的另一表达方式,又称稳定转染。顾名思义相对于瞬转,稳定转染更加“稳定”。这也就是细胞系构建的原理。瞬时转染是将构建的质粒(环状质粒)导入到培养好的细胞内,稳定转染同理,将构建好的质粒酶切(质粒线性化),线性化后的质粒导入到定向驯化培养好的宿主细胞后,线性化的质粒能够和细胞自身的基因组整合,随着细胞的生长分裂能够稳定的表达,这样的一个过程就叫做稳定转染。因为质粒整合到细胞基因组上是一个相对随机的过程(当然我们可以人为的干预,促进其成功率),有的质粒未能成功的进行同源重组,有的重组成功也不能稳定遗传,且重组后的状态也有几种,因此,我们在其重组后进行不断的加压筛选(这就是细胞系构建时间长的原因),最终筛选出能够稳定表达蛋白的细胞株,这就是稳定细胞株的筛选。经过成功筛选的细胞株,直接培养可以大量的生产目的蛋白,虽然前期耗时较长,但节约了后续大规模培养的时间。所以,如果您的蛋白需要大量生产,可以选择德泰稳定细胞系构建。(可以先尝试瞬时转染得到少量蛋白,检测是否能够为您的下游成功应用,在进行稳定细胞系构建)。

实验流程

(一)稳定转染的方法与瞬时转染相同,采用脂质体转染,参考瞬时转染的内容,这里主要介绍一下细胞株的筛选。

(二)细胞株筛选

瞬时转染24-72小时之后,去掉转染液,进行抗生素筛选。

细胞筛选浓度预实验

    • G148的配置:取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中,加蒸馏水至10ml,过滤除菌,4℃保存;
    • 细胞培养:取处于对数生长期的细胞(未转染细胞,一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时),用新鲜无抗生素无血清的培养基制成1×104  个/ml 的细胞悬液。按等量接种入多孔培养板中,培养6h左右开始加药;
    • 制备细胞培养基:在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度,按梯度浓度用培养基稀释G418制成培养基;
    • 加G418筛选:吸除培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的培养基;
      换液:根据细胞活力和培养基的颜色,每三天( 即每隔两天)更换筛选培养基一次。 如细胞生长过快,可以缩短换液时间(每隔一天)。有死细胞勤换液,可以减少对存活细胞的影响;
    • 建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度:筛选10~14天后,可见有抗性的克隆出现,停药用完全培养基培养。当有大量细胞死亡时,可以把 G418浓度减半维持筛选。

预实验确定抗生素的最佳浓度,确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度。

  • 提前一天接种细胞与24孔板中,待第二天长成25%单层为宜,二氧化碳培养箱中37℃过夜培养;
  • 第二天将培养液换成含抗生素的培养基,抗生素浓度按梯度递增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml);
  • 培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准,一般为400-800ug/ml,筛选细胞时刻适当提高浓度;
  • 二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代,使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆,有限稀释法挑取单克隆。
    有限稀释法:将细胞消化下来做连续的10倍稀释,每稀释一梯度都在9孔板中培养,生长一周左右再次挑取单克隆进行培养,如此反复3次;
  • Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况,挑取多个单克隆进行表达检测,筛选出表达量最高的克隆传代并保存。最终进行稳转株筛选高表达的稳定细胞株,相对于瞬时转染,稳定细胞系构建需大量的时间和成本,是满足活性蛋白大量制备的最好方法。
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