返回Western blot实验原理及操作步骤
作为免疫印迹(Western Blot)的基本原理,实验步骤的补充,本文列举免疫印迹的常见问题(FAQ),以供参考。
可能的原因及建议
可能的原因及建议
可能的原因及建议
PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱(不过PBS易污染)。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液则首选PBS。
Western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。
通常情况下只加一种一抗。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。
PVDF膜价格较贵,可重复使用,结合能力较强。
NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性较PVDF膜差,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。
理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。
一般来说用于western的抗体主要识别氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
可以在转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇能增加蛋白质和NC膜的结合能力,同时可以延长高分子量蛋白质转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;选用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。
DAB显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物,该产物难溶于醇和其他有机溶剂,DAB的氧化还能引起聚合作用,导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中,酶将奈酚磷酸(底物)水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐(显色原)结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。
免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应并结合,结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时,会催化底物水解、氧化或还原,从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术,前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上,形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,称为非标记抗体酶技术。
免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,但免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。
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