亲和纯化常见问题分析解决

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1. 通过 His 标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?

(1)如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

(2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

(3)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

2. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

出现这样的情况,主要是缓冲液中 DTT 的影响, DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成

棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与(一般的镍柱耐受小于 5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT)。
3. 镍柱堵了怎么办?

(1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心。

(2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行),还不行加尿素变性,使其在变形环境下。

(3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在1/10-1/15 之间较适宜。
4. 纯化过程中,蛋白出现了浑浊,怎么办?

(1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

(2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。

5. 没能纯化到带 His 标签的蛋白,蛋白都流穿了(未挂柱)?

(1)超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放) ;

  •  策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。

(2)样品或者是结合缓冲液不正确 ;

  • 策略:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份(EDTA)。

(3)组氨酸的标签没有完全的暴露 ;

  •  策略:在变性条件下(用 8M 脲,6M 盐酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。

(4)His 标签丢失;

  • 策略 1:WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达,上游构建,改变his-tag 的位(C-terminal or N-terminal),必要时增加 his 个数(常用 6-10 个);
  • 策略 2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间;
  • 策略 3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。

Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。

6. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?

(1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出最佳的洗脱条件。

(2)降低 PH 的方法洗脱的,因 为若 PH 低于 3.5,会导致镍离子脱落 策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱

(3)蛋白已沉淀在柱上 策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用 8M 脲,或 6M 盐酸胍),最终也可在洗脱 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

(4)非特异性疏水或其他相互反应 策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的浓度。

7. 如何处理样品,可使其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?

(1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。

(2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。

(3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。

(4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。

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