蛋白纯化填料再生实验操作

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亲和层析填料

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镍柱的回收:

  • 将使用完的镍柱用对应的含500mM咪唑的变性或非变性的洗脱液冲洗至基线。
  • 加入DDH2O冲洗3—5个柱体积。
  • 用20%的乙醇冲洗3—5个柱体积。
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中等待再生。

镍柱的再生:

  • 取待再生的镍柱,将其倒入砂芯漏斗中(实验室的滤孔是40uM,大小选择可参考具体的镍柱说明书),滤除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍,0)冲洗柱子,V柱子:V盐酸胍=1:4。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5%SDS冲洗柱子,V柱子:VSDS =1:2。(若SDS析出,用50%乙醇稀释冲洗直至正常)
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(20mM Tris ,100mMEDTA ,PH8.0)冲洗柱子,直至柱子的颜色由蓝色变成白色,V柱子:VEDTA =1:5至1:10。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子与考马斯亮蓝G250反应,无颜色变化方可进行下一步操作,若变蓝则继续重复上述步骤,直至无颜色反应)
  • 加入100mMNiSO4于塑料容器中,V柱子:VNiSO4 =1:3。将其放入15℃,100r/min 的摇床中孵育结合10小时以上(或者过夜),静置后滤除NiSO4溶液,加入等体积的20%的乙醇放置4℃层析柜中待用。

GST柱的回收:

  • 将使用完的GST柱用洗脱缓冲液洗至基线。若洗不掉着用(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍,0)冲洗柱子至基线。
  • 加入DDH2O冲洗3—5个柱体积。
  • 用20%的乙醇冲洗3—5个柱体积。
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中等待再生。

GST柱的再生:

  • 取待再生的GST柱,将其倒入砂芯漏斗中(实验室的滤孔是40uM,大小选择可参考具体的GST柱说明书),滤除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 盐酸胍,0)冲洗柱子,V柱子:V盐酸胍=1:4。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入50%乙醇冲洗柱子,V柱子:V乙醇 =1:4。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子与考马斯亮蓝G250反应,无颜色变化方可进行下一步操作,若变蓝则继续重复上述步骤,直至无颜色反应)
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中待用。

离子交换层析填料

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阴离子/阳离子填料的回收:

  • 将使用完的离子柱用对应PH的含500mMNaCl的变性或非变性的缓冲液冲洗至基线。
  • 加入DDH2O冲洗3—5个柱体积。
  • 用20%的乙醇冲洗3—5个柱体积。
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中等待再生。

阴离子/阳离子填料的再生:

  • 取待再生的离子柱,将其倒入砂芯漏斗中(实验室的滤孔是40uM,大小选择可参考具体的离子柱说明书),滤除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入1MNaCl冲洗柱子,V柱子:VNaCl =1:5。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH冲洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根据污染程度调整NaoH的浓度,不超过1M)
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子与考马斯亮蓝G250反应,无颜色变化方可进行下一步操作,若变蓝则继续重复上述步骤,直至无颜色反应)
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中待用。

分子筛填料的回收与再生SOP

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凝胶柱填料的回收:

  • 将使用完的凝胶柱填料用对应的缓冲液以3ml/min的流速冲洗至基线稳定。
  • 加入DDH2O冲洗3—5个柱体积。
  • 用20%的乙醇冲洗1-2个柱体积。
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中等待再生。

凝胶柱填料的再生:

  • 将待再生的柱子,将其倒入砂芯漏斗中(实验室的滤孔是40uM,大小选择可参考具体的凝胶柱说明书),滤除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH冲洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根据污染程度调整NaoH的浓度,不超过1M)
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(6)(取少量柱子与考马斯亮蓝G250反应,无颜色变化方可进行下一步操作,若变蓝则继续重复上述步骤,直至无颜色反应)
  • 将填料装柱,用水压实,并连上蛋白纯化仪器,以恒定流速3ml/min通入DDH2O压实,(基线稳定)待用。

疏水层析填料

疏水层析填料的回收:

  • 将使用完的疏水柱用不含对应盐的变性或非变性的缓冲液冲洗至基线。
  • 加入DDH2O冲洗3—5个柱体积。
  • 用20%的乙醇冲洗3—5个柱体积。
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中等待再生。

疏水层析填料的再生:

  • 将带再生的柱子,将其倒入砂芯漏斗中(实验室的滤孔是40uM,大小选择可参考具体的疏水柱说明书),滤除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH冲洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根据污染程度调整NaoH的浓度,不超过1M)
  • 加入DDH2O冲洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(4)(取少量柱子与考马斯亮蓝G250反应,无颜色变化方可进行下一步操作,若变蓝则继续重复上述步骤,直至无颜色反应)
  • 将其储存在20%的乙醇中,放置4℃层析柜中待用。
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