细胞转染方法比较

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摘要:对哺乳动物细胞转染表达蛋白来说,选择合适的转染方法和转染试剂对转染的成功率起到决定性作用。本文主要列举了瞬时转染和稳定转染的一些方法、原理及适用性,并列举脂质体细胞转染的步骤、注意事项。

细胞转染,是指将外源基因导入细胞内的一种技术。根据哺乳动物细胞蛋白表达流程,细胞培养完成后需进行细胞转染,根据不同的实验目的选择不同的转染方法。目前,常用的细胞转染方法主要分为三类途径:物理介导(电穿孔法,基因枪法、显微注射法)、化学介导(脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物介导法)、生物介导(病毒介导转染、原生质体转染)。

理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。目前实验室常用的转染方法有脂质体转染,阳离子聚合物转染和病毒转染,不同的转染方法各有利弊,针对细胞的习性和不同的实验目的选择相对合适的转染方法。下面列举了一些常用转染方法的原理,优缺点和适用性:

细胞转染方法比较

细胞转染方法 细胞转染原理 主要特点
阳离子脂质体转染法 带正电荷的脂质体靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物,然后通过细胞的内吞作用进入细胞 a)操作简便
b)适用于各种裸露的DNA和RNA片段
c)适合转染各种的细胞
d)对DNA浓度有一定要求
e)对细胞有一定的毒性
瞬时转染
稳定转染
所有细胞
阳离子聚合物 带正电的阳离子聚合物与核酸的磷酸基团形成带正电的复合物,复合物和带负电的细胞膜接触,并通过内吞作用进入细胞 与脂质体转染法类似,但是具有很低的毒性,操作简单,适用性广,是新一代转染试剂 瞬时转染
稳定转染
所有细胞
磷酸钙法 磷酸钙能够促进外源DNA和细胞的结合,磷酸钙-DNA复合物能够附着到细胞表面,并通过内吞作用进入细胞 a)操作简单
b)对DNA浓度要求高
c)适用性有局限(不适用于原代细胞)
瞬时转染
稳定转染
电穿孔法 高脉冲的电压破坏细胞膜,在细胞膜表面形成孔道,DNA通过孔道进入细胞 a)适用性广,适用于质粒和几十kb的基因组片段
b)针对不同细胞要优化实验条件
c)细胞致死率较高
瞬时转染
稳定转染
所有细胞
显微注射法 利用显微操作系统和显微注射技术将DNA直接注入到细胞中 a)整合率较高,适用于工程改造和转基因动物的建立
b)操作复杂,且需要昂贵精密的设备
c)外源基因的整合位点和拷贝数无法控制,会导致片段缺失、突变
瞬时转染
稳定转染
逆转录病毒转染 通过病毒的膜蛋白和细胞表面的受体相互作用而进入细胞,利用宿主细胞酶自行转录复制合成DNA,并随机整合到细胞基因组中 a)转染效率高,适用于难转染细胞转染
b)利用病毒介导转染,外源基因整合较稳定
c)逆转录病毒只选择感染分裂细胞
d)容纳外源基因长度<8kb
稳定转染
特定细胞转染

脂质体转染步骤

  1. 细胞培养:细胞铺板,加入一定量的细胞培养液,37℃二氧化碳培养箱中培养,待细胞密度生长至80-90%时,准备转染。
  2. 在EP管中,加入无血清稀释的转染试剂,室温放置5min
  3. 在EP管中,加入无血清培养基稀释的DNA,室温放置
  4. 5min,并将二三步得到的两物质混合得到C液,轻轻混匀,室温下放置15-30min。
  5. 用无血清培养基将细胞洗涤两次,在细胞中加入适量的无血清培养基
  6. 将混合得到的C液缓缓加入到细胞中,摇匀,在37℃的二氧化碳培养箱中培养6-24小时。
  7. 细胞培养6-24小时后,吸去无血清转染液,加入正常培养液继续培养

注意事项:

  1. 转染是不能使用含有血清的培养液,血清对转染效率影响很大
  2. 转染前铺板时用无双抗培养基,抗性的增加会影响转染效率
  3. 铺板24小时内进行转染
  4. 整个操作过程轻柔,避免剧烈震荡

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