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蛋白表达常用培养基及缓冲液配置

蛋白表达常用培养基

TB培养基配置

Tryptone 7.2g,yeast 14.4g,甘油3g,磷酸氢二钾9.86g,磷酸二氢钾1.4g,去离子水搅拌溶解,定容至600ml(可分装成两瓶使用),其他量依次放大;

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LB液体培养基配置

Tryptone 1g,yeast 6g,氯化钠1g,去离子水溶解搅拌,定容至100ml;其他量依次放大;
固体LB培养基,按照1.5%的量加入琼脂

2xYT培养基配置

Tryptone 9.6g,yeast 6g,氯化钠3g,去离子水搅拌溶解后定容至600ml;其他量依次放大;

MD选择培养基配置

在80ml的去离子水中加入2g琼脂糖,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),10ml的10x葡萄糖(20g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L);

MM选择培养基配置

在90ml的去离子水中加入2g琼脂糖(20g/L),120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L),0.5ml甲醇(0.5%);

10xYNB配置

134gYNB固体溶于1L的去离子水中,过滤灭菌,4℃保存;

YPD完全培养基

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,葡萄糖20g/L,固体培养基添加1.5%的琼脂;

RDB转化培养基配置

山梨醇186g/L,琼脂糖20g/L,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),10ml的10x葡萄糖(20g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L),100xAA 1ml,搅拌混匀,倒平板(配置100ml灭菌时加入80ml水即可);

100xAA (每种氨基酸0.5%)配置

准确称取L-谷氨酸,L-亮氨酸,L-异亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸各500g溶于100ml去离子水中,过滤灭菌,4℃保存;

BMGY诱导表达培养基配置

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,磷酸氢二钾3g/L,磷酸二氢钾11.8g/L,加水至890ml,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),1ml的500x生物素(4×10-4g/L),甘油10ml;

BMMY诱导表达培养基配置

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,磷酸氢二钾3g/L,磷酸二氢钾11.8g/L,加水至895ml,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),1ml的500x生物素(4×10-4g/L),甲醇5ml;

500x B(0.02%生物素)配置

生物素20mg/100ml去离子水,过滤灭菌,4℃保存;

10xBasal Salts发酵培养基配置

NH4H2PO4 50g/L,CaSO4 0.93g/L,K2SO4 18.2g/L,MgSO4·7H2O 14.9g/L,KOH3g/L,葡萄糖50g/L,磷酸二氢钾5g/L;

上述培养基YNB,甲醇,生物素,氨基酸过滤除菌,葡萄糖108℃灭菌30min,其余120℃高压灭菌20min;

SDS-PAGE凝胶配置

A液:丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,去离子水搅拌溶解,定容至100ml;

B液:Tris 18.2g,加800ml去离子水,调pH至8.8,加入4ml 10% SDS,定容至100ml;

C液:Tris 6.05g,加30ml的去离子水,调pH至6.8,加入2ml 10% SDS,定容至50ml;

D液:10% SDS

AP:10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

TEMED:TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低温保存。

不同浓度的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶配置

溶液成分不同体积的凝胶各成分的体积(ml)
6 %510152025304050
2.65.37.910.613.215.921.226.5
30% A液123456810
1.5mol/L Tris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.5
10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5
10% AP0.050.10.150.20.250.30.40.5
TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04
12%
1.63.34.96.68.29.913.216.5
>30% A液2468101216>20
1.5mol/L Tris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.5
10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5
10% AP0.050.10.150.20.250.30.40.5
TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02
15 %
1.12.33.44.65.76.99.211.5
30% A液2.553.856.37.51012.5
1.5mol/L Tris(pH8.8)1.32.53.856.37.51012.5
10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5
10% AP0.050.10.150.20.250.30.40.5
TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02

琼脂糖凝胶配置配置

根据要分离的样品(DNA)大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。准确称取一定量的琼脂糖干粉,加入到合适体积的锥形瓶中,加入一定量的电泳缓冲液(30ml左右TAE);放入到微波炉内加热融化,冷却片刻(不烫手即可);融化后的琼脂溶液摇晃混匀,倒入电泳槽中,等其凝固;室温下凝固30-40min左右,小心的拔出梳子,取出凝固好的凝胶4℃保存;

蛋白表达常用缓冲液

SDS-PAGE电泳缓冲液配置

配制1L,在1L烧杯中准确称取Tris3.0g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g,,去离子水搅拌溶解,定容至1L;

Western blot转膜缓冲液配置

配制1L,在1L烧杯中准确称取Tris5.8g,甘氨酸2.9g,SDS0.37g,甲醇200ml,加入去离子水搅拌溶解,定容至1L;

SDS-PAGE上样缓冲液配置

① 5xLoading buffer

配制50ml,在1L的烧杯中,准确称取Tris 0.9g,甘油32.5g,SDS 5g,DTT2.75g,溴酚蓝0.125g,加入适量去离子水搅拌溶解,定容至50ml;

② 2xLoading buffer

配制50ml,在1L的烧杯中,准确称取60mM Tris 0.36g,20%甘油13g,4% SDS 2.0g,150mM DTT 1.10g,

0.1%溴酚蓝0.05g,加入适量去离子水搅拌溶解,定容至50ml;

SDS-PAGE电泳染色液配置

R250(1L):在合适体积的烧杯中,准确称取R2501.0g,甲醇450ml,乙酸100ml,充分的溶解。

SDS-PAGE电泳脱色液配置

1L:冰乙酸100ml,甲醇100ml,充分混匀,室温放置;

1X PBS pH7.4配置

500ml 1XPBS,在合适体积的烧杯中,准确称取140mM氯化钠4.1g,2.7mM氯化钾0.1g,10mM NaH2PO4·12H2O 1.79g,1.8mM磷酸二氢钾 0.122g,用480左右ml去离子水搅拌溶解,调pH为7.4,定容至500ml;

1xTAE

配置500ml1XTAE ,准备合适体积的烧杯,准确称取Tris 2.42g,乙酸0.571ml,EDTA(Na)0.186g,加入去离子水搅拌溶解,定容至500ml;