蛋白表达试剂配置

(一)蛋白表达常用培养基

  1. 600ml TB培养基

Tryptone 7.2g,yeast 14.4g,甘油3g,磷酸氢二钾9.86g,磷酸二氢钾1.4g,去离子水搅拌溶解,定容至600ml(可分装成两瓶使用),其他量依次放大;

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  1. 100ml LB液体培养基

Tryptone 1g,yeast 6g,氯化钠1g,去离子水溶解搅拌,定容至100ml;其他量依次放大;
固体LB培养基,按照1.5%的量加入琼脂

  1. 600ml 2xYT培养基

Tryptone 9.6g,yeast 6g,氯化钠3g,去离子水搅拌溶解后定容至600ml;其他量依次放大;

  1. 100ml MD选择培养基

在80ml的去离子水中加入2g琼脂糖,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),10ml的10x葡萄糖(20g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L);

  1. 100ml MM选择培养基

在90ml的去离子水中加入2g琼脂糖(20g/L),120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L),0.5ml甲醇(0.5%);

  1. 10xYNB

134gYNB固体溶于1L的去离子水中,过滤灭菌,4℃保存;

  1. YPD完全培养基

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,葡萄糖20g/L,固体培养基添加1.5%的琼脂;

  1. RDB转化培养基

山梨醇186g/L,琼脂糖20g/L,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),10ml的10x葡萄糖(20g/L),0.2ml的500x生物素(4×10-4g/L),100xAA 1ml,搅拌混匀,倒平板(配置100ml灭菌时加入80ml水即可);

  1. 100xAA (每种氨基酸0.5%)

准确称取L-谷氨酸,L-亮氨酸,L-异亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸各500g溶于100ml去离子水中,过滤灭菌,4℃保存;

  1. BMGY诱导表达培养基

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,磷酸氢二钾3g/L,磷酸二氢钾11.8g/L,加水至890ml,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),1ml的500x生物素(4×10-4g/L),甘油10ml;

  1. BMMY诱导表达培养基

Tryptone 20g/L,yeast 10g/L,磷酸氢二钾3g/L,磷酸二氢钾11.8g/L,加水至895ml,120度灭菌20min,温度下降60℃之后,超净台加入10ml 10xYNB(13.4g/L),1ml的500x生物素(4×10-4g/L),甲醇5ml;

  1. 500x B(0.02%生物素)

生物素20mg/100ml去离子水,过滤灭菌,4℃保存;

  1. 10xBasal Salts发酵培养基

NH4H2PO4 50g/L,CaSO4 0.93g/L,K2SO4 18.2g/L,MgSO4·7H2O 14.9g/L,KOH3g/L,葡萄糖50g/L,磷酸二氢钾5g/L;

上述培养基YNB,甲醇,生物素,氨基酸过滤除菌,葡萄糖108℃灭菌30min,其余120℃高压灭菌20min;

  1. SDS-PAGE凝胶配置

A液:丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,去离子水搅拌溶解,定容至100ml;

B液:Tris 18.2g,加800ml去离子水,调pH至8.8,加入4ml 10% SDS,定容至100ml;

C液:Tris 6.05g,加30ml的去离子水,调pH至6.8,加入2ml 10% SDS,定容至50ml;

D液:10% SDS

AP:10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

TEMED:TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低温保存。

不同浓度的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶配置

溶液成分 不同体积的凝胶各成分的体积(ml)
6 % 5 10 15 20 25 30 40 50
2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5
30% A液 1 2 3 4 5 6 8 10
1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% AP 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04
12%
1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5
>30% A液 2 4 6 8 10 12 16 >20
1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% AP 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
15 %
1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5
30% A液 2.5 5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% AP 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

14.琼脂糖凝胶配置

根据要分离的样品(DNA)大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。准确称取一定量的琼脂糖干粉,加入到合适体积的锥形瓶中,加入一定量的电泳缓冲液(30ml左右TAE);放入到微波炉内加热融化,冷却片刻(不烫手即可);融化后的琼脂溶液摇晃混匀,倒入电泳槽中,等其凝固;室温下凝固30-40min左右,小心的拔出梳子,取出凝固好的凝胶4℃保存;

(二)常用缓冲液

1. SDS-PAGE电泳缓冲液
配制1L,在1L烧杯中准确称取Tris3.0g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g,,去离子水搅拌溶解,定容至1L;

  1. Western blot转膜缓冲液

配制1L,在1L烧杯中准确称取Tris5.8g,甘氨酸2.9g,SDS0.37g,甲醇200ml,加入去离子水搅拌溶解,定容至1L;

  1. SDS-PAGE上样缓冲液,

① 5xLoading buffer

配制50ml,在1L的烧杯中,准确称取Tris 0.9g,甘油32.5g,SDS 5g,DTT2.75g,溴酚蓝0.125g,加入适量去离子水搅拌溶解,定容至50ml;

②  2xLoading buffer

配制50ml,在1L的烧杯中,准确称取60mM Tris 0.36g,20%甘油13g,4% SDS 2.0g,150mM DTT 1.10g,

0.1%溴酚蓝0.05g,加入适量去离子水搅拌溶解,定容至50ml;

  1. SDS-PAGE电泳染色液

R250(1L):在合适体积的烧杯中,准确称取R2501.0g,甲醇450ml,乙酸100ml,充分的溶解。

  1. SDS-PAGE电泳脱色液、

1L:冰乙酸100ml,甲醇100ml,充分混匀,室温放置;

  1. 1X PBS pH7.4

500ml 1XPBS,在合适体积的烧杯中,准确称取140mM氯化钠4.1g,2.7mM氯化钾0.1g,10mM NaH2PO4·12H2O 1.79g,1.8mM磷酸二氢钾 0.122g,用480左右ml去离子水搅拌溶解,调pH为7.4,定容至500ml;

  1. 1xTAE

配置500ml1XTAE ,准备合适体积的烧杯,准确称取Tris 2.42g,乙酸0.571ml,EDTA(Na)0.186g,加入去离子水搅拌溶解,定容至500ml;

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