内毒素去除及内毒素检测的实验操作

原核蛋白表达服务中,细菌内毒素去除和内毒素检测是比较重要的一个环节。本文详细讲解了内毒素去除及检测的原理和操作方法,并附有相关问题解答。
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什么是细菌内毒素?

细菌内毒素系指细菌的死体或细菌代谢物,细菌内毒素的主要成份是产生于革兰氏阴性菌(以革兰氏阴性杆菌最多) 细胞外壁层的脂多糖类物质,其活性主要源于其结构中的类脂A。各种细菌的内毒素大致相同,可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。涉及细胞和动物实验时,一般对内毒素控制都有严格要求。

细菌内毒素具有很强的耐热性和化学稳定性,100 ℃以下无大变化,在120℃高温下加热4小时仅能破坏98%,要完全灭活需在180℃高温下,加热2小时以上,这样的方法进行内毒素去除有相当难度。一般化学药品不影响细菌内毒素的活性,只有强酸、强碱或强氧化剂可以破坏细菌内毒素。

内毒素去除

细菌内毒素去除的原理

因细菌内毒素体积小,耐热性及化学稳定性强,所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活内毒素。现比较常用的内毒素去除方法多为超滤法或亲和层析法。超滤膜孔径(5~100nm) 的下限与细菌内毒素相近,所以可用小孔径的超滤膜去除细菌内毒素。

内毒素去除实验操作

亲和层析内毒素去除的方法较复杂,具体操作如下:

  1. 样品处理:样品的pH值和离子强度在内毒素去除的过程中起着重要作用。虽然结合内毒素的pH 范围在6-9,但是7-8 的pH 范围是纯化的最佳范围。合适的离子浓度可以降低非特异性吸附,0.15-0.5M NaCl 的条件可以得到一个很好的去除效率和低的样品损失。所以,纯化之前可以使用处理过的氯化钠,0.1M 的氢氧化钠或0.1M 盐酸来调节离子强度或pH值。
  2. 活化树脂:将预装柱置于铁架台,垂直固定,去除预装柱顶部的盖子,打开流速控制器,使保护液在重力作用下流干,加入5ml 的再生缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.25ml/min(或者10 滴/min),待再生缓冲液流干,再加入5ml 再生缓冲液,再重复操作两次,确保体系保持无热原(即内毒素)存在。即使是第一次使用也必须进行这一步操作。这步操作大约需要60 分钟完成。
  3. 平衡树脂:活化完毕,加入6ml 的平衡缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.5ml/min,流干平衡缓冲液,再按此操作重复两次。这步操作大约需要40 分钟完成。
  4. 内毒素去除:将流速控制器关闭,使用无热源枪头将样品加入,打开控制器,控制流速不高于0.25ml/min,流出液体积达到1.5ml 后,使用无热源接收管接受样品,样品流干后,再加入1.5ml-3.0ml 的平衡缓冲液淋洗,收集淋洗液。检测样品浓度及内毒素水平。
  5. 再次使用:如果流出样品内毒素水平未能达到预期值,需要将预装柱重新再生,按照步骤1 重新再生,然后上样纯化。
  6. 保存条件:如果预装柱用完后需要保存,先用10ml 平衡缓冲液平衡柱子,待平衡液流干,加入1.5ml 的再生缓冲液(含0.02%的叠氮化钠)

内毒素去除亲和填料的注意事项:

  1. 内毒素去除用的亲和填料每次使用前都需用Buffer处理;
  2. 配制缓冲液要用无内毒素的注射级用水,配制过程要防止引入内毒素;
  3. 适当延长填料与样品溶液的处理时间可以加大内毒素的吸附量;
  4. 如果用磁力搅拌要注意转速别太快,避免搅碎填料;
  5. 样品如果本身是带负性电荷,为增加样品回收率,样品中可以加<0.2M NaCl;
  6. 样品pH可以在7-9范围内;
  7. 样品内毒素太高,超过填料处理量,需要稀释样品找到内毒素的范围,和经内毒素去除后的范围对照,就可以知道效果,如果一次去除不完全,可以重复,直到合格为止;
  8. 内毒素去除使用的亲和填料保存条件为20%乙醇,4~8℃。

内毒素去除实验常见问题:

问题 可能原因 解决方法
 

去除效率低

样品的pH没有在7-8之间 pH调至7-8之间
样品和亲和树脂的接触时间太短 降低样品的流速或进行低温孵育
去除系统受到外来因素干扰 使用无热源的实验仪器
内毒素与目的蛋白结合太牢固 1.增加样品的pH,使它们解离

2.增加样品与亲和树脂的接触时间

 

样品损失高

样品通过非特异性作用结合在亲和树脂上 增加样品与平衡缓冲液中NaCl的量
目的蛋白与内毒素结合牢固,一起结合在亲和树脂上 1.增加样品的pH,使它们解离

2.增加样品与亲和树脂的接触时间

 

样品被污染

树脂处理过其他产品 尽量避免同一个预装柱处理不同样品;如果无法避免,建议

用10-20ml 2M NaCl 淋洗树脂,再处理其他样品

内毒素检测

内毒素检测原理:利用鲎试剂能与内毒素产生凝聚反应的特点,来检测内毒素的含量。

内毒素检测流程图
内毒素检测流程图
  1. 阳性样品对照溶液的制备:将5MVD倍的样品1.0ml与4λ浓度的内毒素标准溶液混合制成2λ浓度的内毒素溶液;
  2. 取8只鲎试剂,每支加入1mlBET(细菌内毒素检查用水)溶解;
  3. 取其中两支作为对照管分别加入0.1ml内毒素标准溶液,2支加入0.1ml混合制成2λ浓度的内毒素溶液,2支加入0.1mlBET作为阴性对照,2支加入0.1ml样品,将8支试剂混匀,封口并放入37摄氏度恒温水浴60min;
  4. 结果分析

① 阳性对照为阳性,阴性对照为阴性,样品阳性对照为阳性,实验成功;

② 若2支样品管都为阳性,样品不符合要求;若2支样品管均为阴性,样品符合要求;若分别为阴阳性,则需重新进行内毒素检测,复试时做4支试剂管有一支为阳性则样品不符合规定。

内毒素检测的注意事项:

  • 鲎试剂是一种生物试剂,建议进行内毒素检测时进行复核;
  • 内毒素检测时稀释所用的仪器不能交叉反复使用;
  • 严格控制内毒素检测时的反应温度和时间;
  • 鲎试剂应该在低温下保存,虽然在温热的条件下鲎试剂还是相对比较稳定的,但是需要避免长时间的置于在高于25℃的温度条件下。在内毒素检测时用的鲎试剂一般只能冻融一次,复溶的鲎试剂需存放在2-8℃的冰箱内或-20℃以下保存。

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