大肠杆菌表达系统

本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。

大肠杆菌蛋白表达原理

诱导原理:Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态,Lac阻遏物能与操纵基因O结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后,其蛋白构象就发生变化,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来,RNA聚合酶不再受阻碍,发生转录。详情见IPTG诱导蛋白表达的原理
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大肠杆菌表达系统步骤

不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化,蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主要包括蛋白表达鉴定:

  1. 表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择
  • 拿到质粒,离心(3000r/min;2min)
  • 在质粒中加入TE(使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng,据此确定加入TE的量),一般为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)
  • 将质粒与TE混匀,加入2μL混液于感受态细胞中
  • 将感受态细胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 取出后立即放入水浴锅中(42℃),热激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
  • 放入摇床(37℃;  195r)中,  30nim至60min; (最佳45min)
  • 取出离心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清悬浮沉淀,吸取50μL悬液涂平板,(先将对应抗性的平板放入培养箱(37℃)中预热20min)
  • 把平板放入培养箱(37℃),过夜(12h至16h)

2.  表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度

  • 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”
  • 将试管放入摇床(37℃;195r)中,(单抗3h左右;双抗4左右;刚开始用可见分光光度计测OD值;熟练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,刚刚看不见枪头即可)),测OD值(0.6至0.8)
  • 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存
  • 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG(终浓度0.5mM最适)
  • 视不同的载体选择适合的表达环境(PET/PGEX:15℃表达过夜;25℃表达6h;37℃表达3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃表达过夜;“2”“3”试管37℃表达3h至4h)。Pcold:全部15℃表达过夜)

3. 表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度

  • 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中,(若OD值不一样,值小的可多取)离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液离心,尽量使沉淀量接近)
  • 在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀,离心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀
  • 在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀(当溶质适量且均一的情况下,加入量不变;当溶质多且粘稠时,应使加入量增大,为降低粘度也可减少上液量)
  • 放入煮样器(100℃) 25min
  • 取出后离心(6000r/min)  3min,  电泳检测。

大肠杆菌表达系统

大肠杆菌蛋白表达系统组成

  • 质粒载体:小型环状DNA,能自我复制。一个完整的质粒载体必须要有复制起点、启动子、插入的目的基因、筛选标记以及终止子;此外对大肠杆菌表达载体的要求是:①操纵子以及相应的的调控序列,外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用;②SD序列,即核糖体识别序列,一般SD序列与起始密码子之间间隔7-13bp翻译效率最高;③多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。
  • 目的基因:在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来,但是真核基因韩有内含子不能,大肠杆菌不能对mRNA进行剪切,从而形成成熟的mRNA,所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。此外还需提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。
  • 表达宿主菌:表达蛋白的生物体即大肠杆菌。表达宿主菌的选择在大肠杆菌蛋白表达过程中是很重要的因素——多数人会直接选择实验室曾经用过的宿主菌,而不去追究原因。对于宿主菌的选择主要根据宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫键,可以选择Origami 2系列,Origami能显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达;目的蛋白含有较多稀有密码子可用Rosetta 2 系列,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA,提高外源基因的表达水平。
大肠杆菌表达现象 可能原因 建议宿主菌
无蛋白表达或出现截短蛋白 密码子偏移性 Rosetta 2

Rosetta gami 2

Rosetta gami B

RosettaBlue

细胞死亡,生长极困难 基因产物为毒性蛋白 pLysS 菌株
蛋白无活性 蛋白错误折叠 Origami 2

Rosetta gami 2

Rosetta gami B

无克隆生长 过高本底表达 pLysS、pLysE 菌株

大肠杆菌表达系统种类

  • T7大肠杆菌表达系统

以T7启动子、T7RNA聚合酶等T7噬箘体转录体系的元件为核心构建的表达系统。T7 RNA聚合酶一种高活性的RNA聚合酶,mRNA的合成速度比大肠杆菌内的RNA聚合酶快5倍,并某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以转录,所以T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下,大肠杆菌本身的转录竞争不过T7噬箘体转录体系,最终受T7噬箘体启动子控制基因的转录。

  • Lac和Tac大肠杆菌表达系统

它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的大肠杆菌表达系统,具有多顺反子结构,结构排列为:

启动子(lacP)- 操纵基因(lacO) – 结构基因(lacZ-lacY-lacA)

原理:在无诱导物的情况下,负调节因子lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。加入诱导剂后,IPTG与lacI基因产物结合,使操纵基因解离出来,lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。

  • PL和PR大肠杆菌表达系统

以启动子PL、PR为核心构建的表达系统。PL和PR表达系统具有很强的启动转录能力,诱导时不需要加入化学诱导剂,成本低廉,但在热刺激过程中,大肠杆菌中的一些蛋白水解酶会被激活,降解所表达的外源蛋白;其次是在大规模发酵培养菌体时,通过热平衡交换方式提高温度,需要较长的时间,这会降低诱导效果,从而对重组蛋白的表达量有影响。

此外还有其他表达系统,如pH调控型、营养调控型、糖原调控型等。

大肠杆菌表达系统比较

种类 优点 缺点
T7大肠杆菌表达系统 目的基因的表达水平高 较高的本底表达
Lac表达系统 易于调控和操作 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合
Tac表达系统 易于调控,转录水平高于lac 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合
PL和PR表达系统 不需要加入化学诱导剂,成本又低廉,转录能力强 可能降解所表达的重组蛋白,不适合大规模培养

大肠杆菌与其他表达系统比较

表达系统 优点 缺点
大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统具有表达背景清楚,表达水平高,操作简单,培养周期短,抗污染能力强 表达真核基因只能用其cDNA,不能进行翻译后的修饰加工,含有大量内毒素
哺乳动物表达系统 可以使蛋白正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等加工修饰,更接近于天然蛋白 产率低,某些糖基化产物不稳定、不易纯化,费用昂贵
酵母表达系统 使用简单,表达量高,可大规模生产,与原核相比可对异源蛋白修饰 酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。
昆虫表达系统 高效表达,完善的加工修饰,易从无血清上清中纯化蛋白,无内毒素 外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,由于病毒感染,细胞开始死亡,无法进行连续性表达

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原核表达常见问题(主要包括蛋白不表达,蛋白表达不在上清,包涵体复性解决等相关问题)。

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