基因合成的原理与应用

摘要:基因合成是体外合成双链DNA的一种方法,是获取目的基因的手段之一,本文主要介绍了不同获取目的基因的方法及基因合成的原理、应用与优势。

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人工合成基因出现在上世纪60年代,通过基因合成,可以获得自然界中不存在的基因。目前,获取目的基因的方法主要有三种:逆转录,PCR扩增,人工合成 。逆转录法主要适用于获得分子量较大的未知序列的基因,它以目的基因的mRNA为模板,设计上下游引物,借助逆转录酶合成碱基互补的DNA链(即cDNA),在DNA聚合酶的作用下合成cDNA,即目的基因的双链DNA。PCR主要适用于已知序列的扩增,获得大量的目的片段,供人们肉眼观察(RT-PCR可实现对起始模板的定量分析)。人工合成法就是采用化学合成的方法获取目的片段,化学合成准确率较高,速度较快,同时根据不同的下游应用和密码子的偏爱性,设计基因序列,提高表达水平。

原理

DNA合成的方法主要采用固相亚磷酰胺三酯法,运用此方法的DNA合成仪有很多,常用的有ABI 394合成仪、ABI39OO高通量合成仪,它们的区别主要在合成效率,试剂用量,耗时等方面,合成的原理是相同的,合成原理如图:

基因合成

Step 1:DMTro是5’羟基的保护基团,用TCA(三氯乙酸)和预先连接在固相载体(CPG)上的核苷酸的5’端发生反应,脱去DMT,使5’羟基端游离

Step 2:亚磷酰胺保护的dNTP和活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,此时3’端被活化,5’-羟基被DMTro保护

Setp 3:1、2步的产物发生缩合反应偶联,形成新键C-亚磷酯键

Setp 4:1中会剩下部分未参与反应的5’-羟基,通过乙酰化的方法封闭5’-羟基

Setp 5:3步形成的C-亚磷酯键不稳定,易被水解,所以用氧化剂碘将其氧化成更稳定的磷酸三酯键

通过以上步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体上,将其5’端的DMTro切除,重复以上步骤合成所有需要的碱基,最后经过氨水高温处理,将合成的链从固相载体CPG上切下来,根据不同的下游应用纯化处理后保存。

PCR扩增简单方便,但不能保证基因序列的完全正确性,扩增存在突变风险,且PCR对模板也具有一定的要求,因此适用性存在局限性,相对于此基因合成具有如下优势:

优势

  1. 可以保证基因序列的完全正确性,无突变
  2. 合成周期短
  3. 不受模板来源限制
  4. 根据不同应用,设计优化基因序列,提高表达水平

应用

人工基因合成具有极大的灵活性,根据需求自行改变设计序列

  1. 进行基因优化,提高基因表达
  2. 合成已知序列的难扩增基因
  3. 合成大量用于微芯片的cDNA
  4. 克隆人鼠抗体或重组抗体
  5. 设计合成基因疫苗、基因治疗载体
  6. 根据基因的结构功能研究,修改设计基因
  7. 合成不同的基因突变株、SNPS、或其它突变株
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