磁珠蛋白纯化流程

蛋白亲和纯化介绍 常见的蛋白纯化技术
磁珠蛋白纯化流程主要包括四大步:缓冲液准备,样品制备,磁珠准备,目的蛋白纯化。

缓冲液的准备

缓冲液可使用下列推荐缓冲液,也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系,基本原则就是低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。缓冲液在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。因为Ni-IDA Magnetic Beads可以用于可溶性蛋白和包涵体蛋白的纯化,两种方法所需缓冲液不同,具体配置方法见下表。

名称 体积 配方
结合缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36g imidazole)
使用HCl溶液调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
清洗缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36g imidazole)
使用HCl溶液调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
洗脱缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
300 mM Imidazole (20.4g imidazole)
使用HCl溶液调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

表1:可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

上述缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化,在结合缓冲液中添加一定浓度的咪唑可以降低非特异性结合,提高目的蛋白的纯度。初次使用的客户,可以采用推荐的缓冲液,再根据实验结果进行调整缓冲液中的咪唑的浓度。

名称 体积 配方
结合缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
清洗缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl溶液调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
洗脱缓冲液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
300 mM Imidazole (20.4g imidazole)
使用HCl溶液调节pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

表2:包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

样品制备

细菌或酵母表达的蛋白

蛋白表达培养结束后,将培养液转移到离心杯中,离心收集菌体,然后按料液比1:10~20加入结合缓冲液,在破碎前加入1 mM PMSF、去污剂1%Triton™ X-100和还原剂1 mM TCEP(同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合)。将菌体沉淀悬浮起来,混匀,放置于冰浴中,然后冰上超声破碎细胞,直至菌液基本澄清。将澄清的破碎液转移至离心管中,离心。取上清,置于冰上备用或-20度保存。

酵母、昆虫和哺乳动物细胞分泌表达可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心杯,离心收集菌体和上清液,如上清液中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质,即可直接加入磁珠使用;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,需用结合缓冲液,4℃下透析后才能加入磁珠。对于大量体积的上清,需加入硫酸铵沉淀浓缩后,蛋白还需用结合缓冲液,4℃透析后才能使用。

磁珠准备

磁珠准备

用户需要根据目标蛋白的表达情况确定菌体、细胞或上清液与磁珠用量的比例。下表以纯化2 mg目标蛋白的纯化为例,20%磁珠悬液用量为0.2~0.5 mL。

目标蛋白量 样品体积 20%磁珠悬液用量
2 mg 10 mL 0.2~0.5 mL

将Ni-IDA Magnetic Beads充分混匀,使用移液器取适量的磁珠悬浮液,置于离心管中,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃上清液。

磁珠平衡

再将离心管从磁分离器上取下来,加入0.5 mL的结合缓冲液,使用枪头反复吹打5-10次,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃上清液,重复上述步骤2次。

目的蛋白纯化

磁珠结合目的蛋白

将破碎液加入到平衡好的磁珠中,颠倒混匀。将离心管置于混合仪上,置于4℃下孵育1h。

洗杂

将离心管置于磁分离器,待溶液变澄清后,用移液器移出上清液,保留,以备取样检测。向离心管中加入1 mL的清洗缓冲液,使用枪头反复吹打5-10次,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸取上清液,保留,以备取样检测。重复上述步骤2次。

洗脱

目标蛋白可以根据需要改变洗脱体积从而调整洗脱下的目标蛋白浓度。建议将1 ml洗脱缓冲液加入到离心管中,使用移液器轻轻吹打3-5次,混匀,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸取上清液,即为目的蛋白组分。如有需要,可以重复上述步骤2-3次,以提高目的蛋白的回收量。

磁珠后处理

  • 向装有磁珠的离心管中加入2 ml洗脱缓冲液,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠充分悬浮,然后,置于磁分离器,吸弃上清液,重复该操作2次。
  • 向该离心管中加入2 ml去离子水,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠充分悬浮,然后,置于磁分离器,吸弃上清液,重复该操作2次。
  • 加入20%的乙醇溶液,使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积,保存于2-8 ℃。

SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。

磁珠再生

组氨酸标签蛋白亲和纯化磁珠所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当磁珠载量明显变低时,需要进行对磁珠进行镍离子剥离和重新挂镍离子,也就是再生。按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。

  • 使用50 mM Tris-HCl(pH8.0)溶液(含6 M Gua-HCl)清洗2倍柱体积;
  • 使用去离子水清洗5倍柱体积;
  • 使用0.1% SDS清洗3倍柱体积;
  • 使用去离子水清洗5倍柱体积;
  • 使用70%乙醇清洗5倍柱体积;
  • 使用去离子水清洗5倍柱体积;
  • 使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗5倍柱体积;
  • 使用去离子水清洗5倍柱体积;
  • 使用100 mM NiSO4清洗5倍柱体积,与填料混合,于摇床中15℃,100rpm孵育过夜;
  • 使用去离子水清洗10倍柱体积;
  • 再生的磁珠结束后,可以立即使用,如不立即使用,需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中,置于2-8 °C保存。

流程优化

以上操作流程适用于大部分组氨酸标签蛋白的纯化,根据目标蛋白与金属螯合磁珠的结合性能不同,用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化,以提高目标蛋白的回收率和纯度。
1、提高目标蛋白回收率的参考方法:

  • 降低样品中的咪唑浓度;
  • 样品中添加表面活性剂等物质;
  • 添加合适的蛋白酶抑制剂,防止目标蛋白降解;
  • 增加磁珠用量;
  • 延长蛋白与磁珠孵育的时间;
  • 提高洗脱缓冲液中的咪唑浓度;
  • 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。

2、提高目标蛋白纯度的参考方法:

  • 提高样品中的咪唑浓度;
  • 向样品中添加表面活性剂等物质;
  • 添加合适的蛋白酶抑制剂,防止目标蛋白降解;
  • 延长洗涤的时间,增加洗涤次数;
  • 采用梯度咪唑浓度洗脱目标蛋白。
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