离子柱常见问题分析及解决方案

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摘要:本文主要针对离子柱纯化蛋白中常见的问题进行分析,解释其原因并提出相应的解决方案。

缓冲液如何选择

用Tris-HCl还是PB,选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好,浓度一般50mM,但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

洗脱采用的离子强度的大小范围应该如何确定

离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大,洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大,0.01mol/l到1mol/l,甚至3.0mol/l,PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。

蛋白挂在阳离子交换柱上洗脱不下来

  1. 蛋白与离子柱得结合太强,换弱阳的琼脂糖凝胶介质,比如由sp的换成CM。
  2. 减少离子柱与样品的结合时间,防止蛋白沉在柱上。
  3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用0.1M氢氧化钠洗。

标签蛋白易洗脱

  1. 离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白,最大可能性是上样量过大,流速太大,建议增加清洗的体积数,减少上样量,降低上样速度。
  2. 上样完洗脱前,清洗的不彻底。
  3. 标签没有表达出来:
    • 可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合。
    • 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。
  4. 填料有问题,换填料。
  5. PH、离子强度是否合适,平衡缓冲液是否应与样品缓冲液pH、离子强度相同。

标签包涵体蛋白易洗脱

  1. 蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签,而使得蛋白质无法挂柱。
    • 因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻碍了标签与离子柱形成共价键。
    • 环境影响:pH,离子强度,其他蛋白质分子,缓冲溶液类型,有关影响蛋白质分子表面的试剂等。增加所提的蛋白质样品的溶解度或还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型。
  2. 柱子没平衡好,平衡缓冲液没加咪唑,平衡液PH不适合,缓冲液pH要与蛋白质pI差1-2。
  3. 有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合,通过降低洗脱液pH值使得标签质子化而使得污染蛋白质从层析住上被洗脱。
  4. 一些蛋白质或DNA与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用,可以用低浓度的去污剂(2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品(上样洗脱时)或增加洗脱液的盐浓度(氯化钠溶液低于2mol/L)。
  5. 填料有问题,换填料。
  6. 最后可以考虑一下试剂的问题。

目的蛋白先洗脱杂蛋白被吸附

  1. 更换缓冲液,可能pH与蛋白质pI较接近。
  2. 填料选择不对,与蛋白结合力太弱,更换适合改纯化蛋白质的填料。
  3. 直接收取目的蛋白,再用其他纯化方法进一步纯化。

蛋白纯化出现沉淀

  1. pH发生变化,导致蛋白质沉淀。
  2. 离子溶度过高,缓冲液的离子溶度降低。

注意事项

  1. 倒入速度不要太快,以防产生泡沫和气泡。
  2. 装柱的注意事项:
    • 装柱时应注意液面不能低于树脂表面。
    • 树脂悬浮液的温度要相对恒定或与室温接近,否则柱床体内易产生气泡而影响分离效果。
    • 装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡,并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱。
    • 在装柱的同时应该将其他仪器设备(如:恒流泵等)电源接通,并按实验要求进行预热和调试。需将恒流泵流速调至0.4ml/min。
  3. 应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样,且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 (第一管,应在4ml处做一标记)。
  4. 加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中,以免冲坏树脂表面,以及在柱内形成气泡,影响分离效果。
  5. 20%乙醇保存柱子。
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