酵母蛋白表达步骤/实验流程

本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤,详细酵母表达流程。从感受态细胞制备,转化方法选择及操作,从化学试剂PEG1000转化,电击转化,原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达,全套酵母蛋白表达标准操作流程。
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质粒线性化

在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理,因此线性化是酵母转化的第一步,采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

转化方法 转化效率 是否会多拷贝整合 操作
原生质体法 105 操作复杂
电穿孔法(电击) 105 操作方便
PEG诱导转化 105 操作方便

毕赤酵母PEG1000转化及感受态制备

  • 配置缓冲液

1)缓冲液A:1.0M 山梨醇,10mM甘氨酸,pH8.35,3%(v/v)乙二醇,滤膜过滤,-20℃保存;

2)缓冲液B:40%(w/v)PEG1000,0.2M 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;

3)缓冲液C:0.15M NaCl,10mM 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;

4)未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存

将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;样品的转化,进行多组试验。

  • 感受态制备

1)接种酵母受体菌单菌落于YPD平板(YPD:蛋白表达试剂配置),30℃培养2天;

2)挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;

3)过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD培养基中震荡培养至OD值从0.1至0.5~0.8;

4)3000~5000rpm离心收集沉淀菌体,用50ml预冷A液洗涤,并重悬与4mlA液中;

5)根据每次使用量(0.1-0.2ml