酵母蛋白表达步骤/实验流程

本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤,详细酵母表达流程。从感受态细胞制备,转化方法选择及操作,从化学试剂PEG1000转化,电击转化,原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达,全套酵母蛋白表达标准操作流程。
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质粒线性化

在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理,因此线性化是酵母转化的第一步,采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

转化方法 转化效率 是否会多拷贝整合 操作
原生质体法 105 操作复杂
电穿孔法(电击) 105 操作方便
PEG诱导转化 105 操作方便

毕赤酵母PEG1000转化及感受态制备

  • 配置缓冲液

1)缓冲液A:1.0M 山梨醇,10mM甘氨酸,pH8.35,3%(v/v)乙二醇,滤膜过滤,-20℃保存;

2)缓冲液B:40%(w/v)PEG1000,0.2M 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;

3)缓冲液C:0.15M NaCl,10mM 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;

4)未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存

将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;样品的转化,进行多组试验。

  • 感受态制备

1)接种酵母受体菌单菌落于YPD平板(YPD:蛋白表达试剂配置),30℃培养2天;

2)挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;

3)过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD培养基中震荡培养至OD值从0.1至0.5~0.8;

4)3000~5000rpm离心收集沉淀菌体,用50ml预冷A液洗涤,并重悬与4mlA液中;

5)根据每次使用量(0.1-0.2ml左右)分装与1.5ml离心管中,每管加入10ul的预冷DMSO,混合后迅速-80℃/液氮(感受态可以放到-80℃ ,但是酵母表达建议感受态现做现用)

  • 酵母转化

1)线性化质粒50ug(可预冷)溶于200ul的TE中,直接加入冻存的酵母感受态中;

2)37℃水浴5min,过程混合样品2次;

3)取出加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;

4)30℃水浴1小时;

5)室温2000rpm离心10min,去上清,得沉淀,重悬菌体与1.5ml缓冲液C中;

6)再次离心,去上清,得沉淀,轻轻加入0.2ml缓冲液C重悬;

7)将重悬的转化液涂与选择性培养基(根据抗性配置)中,30℃孵育3-4天,进行鉴定。

毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

  • 感受态制备

1)接种酵母受体菌单菌落于YPD平板,30℃培养2天;

2)挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;

3)过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD培养基中震荡培养至OD值1.2~1.5;

4)4℃,5000rpm离心5min收集沉淀菌体,用100ml预冷无菌水重悬菌体;

5)4℃,5000rpm离心10min收集沉淀菌体,用100ml预冷无菌水重悬菌体;

6)再次4℃,5000rpm离心10min收集沉淀菌体,用100ml预冷无菌水重悬菌体;

7)20ml,1mol/L山梨醇洗涤1次;

8)将菌体溶于200ul,1mol/L预冷山梨醇中,不加甘油,-80℃放置几小时,待转化

  • 酵母电转

1)准备好80ul的酵母感受态与线性化的质粒1-5ug(冰上预冷15min)混合,迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌),电击;

2)电击结束,迅速加入1ml山梨醇,涂平板(在摇床上培养1h后涂平板也可);

3)MD培养基生长3-4天,ROB培养基上生长4-5天后,鉴定。

  • 电击注意点

1)线性化质粒的含量在1-5ug,纯度越高越好,量要有保证,很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成;

2)感受态菌液收集,确定OD值在1.2-1.5之间,可以稀释不同倍数,判断是否是线性关系,菌液浑浊单OD值不高,可能是OD稀释倍数不够;

3)感受态保存,感受态制备但其他还没处理好,冰上放置的时间对转化效率也会有影响,因此还是那个原则:现做现用;且分装成每次够用的量,一旦拿出就不在放回,也避免每次吸取造成污染;

4)电击杯清洗,先洗净吹干,浸泡在75%乙醇中,使用前超净台紫外灭菌,重复使用对实验也会有一定影响;

5)电击参数,电压及电击时间可以摸索,适当增加电压或延长电击时间,电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

  • 原生质转化原理

酵母细胞具有细胞壁,细胞壁会组织其对外源DNA的摄入,因此,去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对DNA的吸收。利用藤黄节杆菌酶(为一种葡聚糖酶),可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁,否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到SDS的影响,可以加入SDS对其消化进行控制,以得到消化适度的细胞。消化获得70%的原生质细胞时,效果最好。

  • 试剂配制

转化当天,配制如下溶液:

① SE:1M山梨醇,25mM EDTA,pH8.0

② SCE:SE:1M山梨醇,1mM EDTA,10mM柠檬酸钠缓冲液,pH8.5

③ SOS:1M山梨醇,0.3xYPD,10mM CaCl2

④ CaS:1M山梨醇,10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM CaCl2

⑤ DTT,PEG:DTT水配制为1M浓度,PEG用水配制40%(w/v)

⑥ CaT:20mM Tris pH7.5,20mM CaCl2

⑦ 藤黄节杆菌酶:用水配制成3mg/ml的浓度

⑧ 5%SDS溶液,RD融化琼脂100ml,1M山梨醇

每次转化时配制

① SED:19mlLSE加1ml DTT

② PEG/Cat:1:1混合40%PEG及Cat

其他试剂

① YPD培养基1L,YPD平板1L

② RDB平板1L,RDHB平板1L

  • 感受态制备及消化细胞壁

1)接种酵母受体菌单菌落于YPD平板,30℃培养2天;

2)挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;

3)取培养的细胞5ul,10ul,20ul分别加入到含有200mlLYPD的液体培养基中,30℃震荡过夜(300rpm);

4)第二天测每个培养瓶中的OD600值,并取出事先配置好的转化溶液,室温放置:

5)收集OD600值在0.2-0.3对应的培养瓶中的细胞,室温离心(1500rpm5min左右),得到沉淀;如果没有培养瓶中的OD值在0.3左右的话,选择一个培养瓶,用新配置的培养基以1:4稀释,再次培养(2-3h左右),直至出现OD值为0.2-0.3,收集细胞;

6)准备去除细胞壁,准备去壁试剂和待去壁的细胞;

7)准备去壁试剂:现配SED,保证DTT(分析级)的新鲜度,配完放-20℃;

8)准备带去壁细胞:先用灭菌水清洗,转入离心管;1500rpm离心5min,收集细胞,用20mlSED重悬并洗涤离心;再次用1M山梨醇洗涤,离心(同上);用SCE重悬,分开至两个离心管中(每管10ml左右);

9)准备藤黄节杆菌酶,取一管酶放置冰上,以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶,开始消化细胞(这一步可确定酶消化的最佳时间);

最佳时间的确定

① 准备20ml 5%SDS溶液分光光度计调至800nm,空白对照为800ul5%SDS及200ul SCE;

② 准备10个离心管,编号为0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根据时间编号);

③ 取上述8步中的另一管细胞,取出200ul加入至0号管中,放置冰上,此为0点;

④ 加入7.5ul藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中,轻混,30℃孵育(不要晃动)用来建立最佳时间所用

⑤ 2min时取200ul悬浮液至2号管中,同理4,5,6,7,8min时重复操作,读样品OD800值;

⑥ 用公式计算细胞去壁的效率:%去壁率=100-{(T时间OD800-0时间OD800值)x100}

10)计算出去壁率为70%左右时,得出最佳消化时间,同样操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化细胞

11)室温离心去除悬浮液,1M山梨醇洗涤一次,0.6mlCaS悬浮细胞,立即转化,去壁的细胞应立即转化。

  • 转化毕赤酵母

1)取100ul将去壁细胞,放入1.5ml离心管中(灭菌);

2)准备10ug线性化质粒(预冷)与去壁细胞混合,加入1ml新鲜PEG/Cat溶液,轻混,室温孵育10min;

3)室温750rpm离心10min,去除PEG/Cat溶液;并用150ulSOS培养基悬浮转化细胞,室温孵育20min;

4)加入800ul 1M山梨醇,涂平板;

5)取200ul转化细胞和RD(液体)混匀倒于RDB平板上,凝固后导致平板,30℃培养4-6天,出现转化子;

6)取100ul稀释细胞,与RDH(液体)混匀,涂在RDHB上,凝固后倒置生长,30℃培养4-6天,出现克隆,表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

  • Mut+和Muts表型的判断

待转化子在平板上生长一段时间后,进行Mut+和Muts的筛选。挑取单克隆,在MM及MD培养基上划线或点(先在MM平板上点,再在MD平板上点,一个克隆换一次牙签),30℃培养2天。观察,在MD培养基上生长而在MM培养基上不生长或长的很小即为Muts表型,其余为Mut+表型。

  • Mut+的诱导表达

1)挑取单菌落,摇菌,在25mlMGY或BMG或BMGY培养基中,30℃,300rpm培养至OD600为2-6(培养15-18h左右观察);

2)室温2000rpm离心5min,收集菌体,用上述培养基重悬,使OD600为1.0左右;将菌液至于1L摇瓶中,30℃300rpm培养,每24小时加入100%甲醇,至终浓度为0.5-1.0%;

3)根据时间点取样(1ml)至于1.5ml离心管中,离心收集上清和菌体,分析蛋白表达量和最佳收获时间;

4)可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。

  • Muts的诱导表达

1)挑取单菌落,摇菌,在25mlMGY或BMG或BMGY培养基中,30℃,300rpm培养至OD600为2-6(培养15-18h左右观察);

2)室温2000rpm离心5min,收集菌体,用上述培养基重悬,使OD600为1.0左右;将菌液至于1L摇瓶中,30℃300rpm培养,每24小时加入100%甲醇,至终浓度为0.5-1.0%;

3)根据时间点取样(1ml)至于1.5ml离心管中,离心收集上清和菌体,分析蛋白表达量和最佳收获时间;

4)可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。

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