酵母表达原理

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本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理,毕赤酵母表达能够高效表达的机制。
巴斯德毕赤酵母(以下简称毕赤酵母)能够高效表达外源基因,是因为其有更强的强启动子,即醇氧化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢,在此反应中参与的酶是醇氧化酶(AOX1和AOX2)。其中,AOX2的表达量比AOX1低得多,以甲醇为唯一碳源时,AOX1增至细胞总蛋白的40%。PAOX1受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此,AOX1的表达受到甲醇的严格控制。

巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上,这是通过把携带外源基因的表达质粒线性化,以同源重组的方式整合到强启动子PAOX1的下游,目的基因一般插入到5’AOX1启动子和转录终止子之间的单克隆位点。

毕赤酵母蛋白表达系统

  1. 酵母表达宿主菌
  • Mut+和Muts

在毕赤酵母表达系统中,乙醇氧化酶有两种基因编码,即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力有AOX1提供,菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失,只存在AOX2时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,这种细胞利用甲醇能力低,在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为Muts。存在AOX1,细胞利用甲醇正常生长,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表现型为Mut+,这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Muts和Mut+产生的原理。

  • 酵母表达系统常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表达宿主菌,均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型,如果表达载体上带有组氨酸基因,可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷,所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时,AOX1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,宿主菌的AOX1基因被强烈诱导,使目的基因大量表达。

  • 有无甲醇诱导产生的Mut+和Muts表现型

毕赤酵母的最适生长温度为28-30℃,诱导期间超过32℃,不利于蛋白表达,并可能导致细胞死亡。Muts和Mut+菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样,存在甲醇的情况下,AOX1启动子被强烈诱导,Mut+较Muts生长更快(4-5倍)。

  1. 酵母蛋白表达载体
  • 酵母蛋白表达载体的选择

酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式,这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽,可根据基因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。

① 胞内表达载体:主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。该类载体将目的基因表达在胞内,可避免酵母的糖基化,适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白,较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

② 分泌到胞外表达的载体:pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少,将外源蛋白分泌到胞外,有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由89个氨基酸组成α交配因子的引导。

③ 多拷贝插入表达载体:pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下,重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

  • 表达重组蛋白使其具体天然的N端

想实现表达重组蛋白使其具体天然的N端,将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点之后。Kex2蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala  *位置为Kex2蛋白酶的酶切位点

毕赤酵母表达系统机制/原理

毕赤酵母能够高效的表达外源基因,是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子(AOX1和AOX2)。AOX1和AOX2及其产生的Muts和Mut+表现型前文已经叙述过。AOX1受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上,通过把构建的质粒/载体线性化(主要采用酶切),通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游,一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。

毕赤酵母同源重组的方式,见酵母蛋白表达系统介绍。

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