PCR实验操作注意事项

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PCR技术具有重复性好、灵敏度高、快速简便等突出优点,是科研研究最常用到的技术之一。但是由于灵敏度高,实验操作人员细微的操作失误就可能导致产生污染或没有扩增出目的条带,因此PCR实验对操作有一定的要求。本文对PCR实验操作中的注意事项、PCR实验污染问题及预防措施做一介绍。

PCR实验操作注意事项

材料准备

  • PCR所用试剂除buffer外均不宜反复冻融,试剂最好分装使用。
  • 模板:PCR所用的模板一般稀释至纳克数量级,用量不宜过多,模板浓度过高会导致PCR实验失败(如何确定模板的用量?)。同时模板内避免含有酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等物质。
  • 引物:详细引物设计原则请参见“PCR引物设计”一文。反应体系中引物浓度要合适,太高容易引起错配及非特异性产物的形成。
  • 酶:为了降低非特异性反应,酶最好最后加入PCR反应体系中。
  • dNTP:四种dNTP的浓度要相同且浓度不宜过高,否则会引起错配。

实验操作

  • 对照设置:最好设置阳性、阴性对照。设置阳性对照可证明实验体系正常,防止PCR抑制造成的假阴性。阴性对照可验证是否存在基因组DNA的污染。
  • 添加试剂:PCR试剂对温度十分敏感,最好需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃,所有试剂加好后要混匀。
  • 电泳检测:扩增产物最好在48h以内检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失;

PCR常见问题分析及解决方法介绍

PCR污染问题

PCR实验中一个令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染就可造成假阳性结果。导致污染的原因有:
样本污染:收集标本的容器被污染;标本放置时,由于密封不严溢于容器外;容器外沾有标本造成交叉污染
试剂污染:在PCR试剂配置过程中,由于加样器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染;
PCR产物污染:最主要的污染源。如果在PCR实验过程中形成了气溶胶(在空气与液体面摩擦时、在操作时比较剧烈的摇动反应管,开盖时、吸样时及污染加样器的反复吹打都可形成气溶胶,一个气溶胶可含48000拷贝),则气溶胶可能对之后进行PCR扩增实验产生污染。

防止措施

  • 实验分区:将实验分在4个区域进行,分别为试剂储存和准备区,样品制备区,扩增区,扩增产物分析区。各个区域相互独立,仪器设备和各种物品分开,不能串用;
  • 实验前后按要求作好实验室的清洁消毒工作,特别是实验完成后,消毒工作一定要彻底,破坏残留的DNA;
  • 降低PCR实验的频率(例如能一次做50个,不要分开5次每次做10个);
  • 在PCR实验操作过程中,工作人员都必须戴胜手套,并经常更换(加模板DNA后必须更换);
  • 每次实验前应做好吸嘴、Rppendorf管、反应管、加样器、离心管等物品的高温消毒。常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染;
  • 试剂管用前先瞬时离心(离心10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会;
  • 引物稀释时,要首先瞬时离心,以避免粉末状引物在开盖时弹出管外;
  • 正确使用加样器:吸样时要特别小心应缓慢匀速,避免液体溅到加样器头上,尽量一次性吸完,忌反复多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶。打出液体后拇指不应松开按钮,将吸嘴压掉后再将拇指松开,避免液体回吸;
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