PCR问题及提高PCR扩增特异性的方法总结

相关技术：PCR标准操作流程

本文根据自身实验经验总结，针对PCR实验过程出现的问题举例，提供可实施的解决方法。并根据经验列举了提高PCR反应特异性的方法。

PCR常见问题分析

问题1：假阴性（无扩增产物）

现象：正对照有条带，样品无条带

可能原因：

• 模板：含有Taq酶抑制剂、杂蛋白，模板上样量低或模板降解
• 引物：引物降解，引物设计不合理
• 试剂：酶失活，buffer不合适
• 反应条件：退火温度高，延伸时间短

解决方法：

• 纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂
• 重新设计引物并低温保存
• 优化buffer，摸索镁离子浓度或适当加入DMSO（小于0.3%）
• 提高退火温度，增加延伸时间（反应条件参照试剂盒说明书）

问题2：假阳性

现象：空白对照出现条带

可能原因：

• 引物设计不适，与目的序列具有同源性
• 试剂污染：水、移液枪等被核酸污染
• 样品间出现交叉污染

解决方法：

• 实验仪器高压灭菌
• 实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用
• 规范实验操作
• 假阳性可通过巢式PCR解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增

问题3：拖尾、弥散

现象：电泳出现拖尾、涂抹带

可能原因：

• 酶用量过多
• 模板纯度较低
• dNTP、镁离子浓度过高
• 循环次数过多

解决方法：

• 减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增
• 纯化模板
• 减少dNTP用量，摸索镁离子浓度
• 减少循环次数

问题4：二聚体及非特异性产物

一般小于100bp的条带可基本判断为引物二聚体

主要原因：

• 引物设计不合理，引物自身具有互补性
• 引物浓度不适
• 镁离子浓度过高，退火温度过低

解决方法：

• 重新设计引物并进行BLAST检测
• 降低镁离子浓度，提高退火温度
• 增加模板用量

提高PCR反应特异性的方法

1. 引物的设计

引物最好在模板cDNA的保守区设计，长度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超过连续三个G或C，碱基分布错落有致，避免引物自身形成二聚体，设计完成之后，需进行BLAST检测，如果与其他基因不具有互补性，则可以进行下一步实验。

1. 降落PCR

降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR，最大的优点就是可以降低实验耗时，同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度，退火温度过高会使PCR效率过低，过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。

1. 热启动扩增

采用热启动方法进行扩增，是除了设计最佳引物之外，提高PCR反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中，试剂的配置需在冰上进行，且要将PCR仪预热，这种方法就类似于热启动，能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性，只要体系中有DNA链存在，就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用热启动酶或高保真酶去扩增，它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心，当温度上升到95℃时恢复活性，指导扩增。

1. 巢式PCR

采用巢式PCR进行扩增，在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是，它采用两对引物进行扩增，首先用第一对引物普通PCR，然后将第一轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物（巢式引物）二次扩增。因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。

1. 合适的琼脂糖凝胶的浓度

琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围