蛋白质芯片技术检测蛋白质间相互作用

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传统的相互作用分析方法(如GST-pull down免疫共沉淀酵母双杂交技术等)在大规模研究蛋白相互作用方面有着一定的局限性。随着生物芯片技术的发展,蛋白质芯片技术被应用于蛋白间相互作用研究。蛋白质芯片技术能够快速、高通量的进行蛋白质相互作用的研究。

产生背景

蛋白质芯片技术的产生得益于生物芯片技术的发展。1991年美国Affymetrix公司成功研制了世界上第一块DNA芯片,从此拉开了研究生物芯片技术的帷幕。DNA芯片可以应用于对生物样品中的各种已知/未知核酸序列的表达进行检测和比较,但DNA芯片在对蛋白质功能结构的研究方面有很大的限制。为了进一步对蛋白质的功能与结构进行研究,蛋白芯片技术应运而生。

实验原理

蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列,是一种体外检测相互作用的方法。其基本原理是以蛋白质分子作为配基(探针蛋白),将其有序地固定在固相载体(滴定板、滤膜、玻璃片等)的表面形成微阵列;用带有荧光标记的蛋白质(或其它分子)与之作用,经漂洗将未结合的成分洗去,经荧光扫描等监测方式测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系,由此达到测定各种蛋白质功能的目的。
蛋白芯片技术原理
图1:蛋白芯片技术原理

蛋白质芯片检测蛋白相互作用操作流程

蛋白质芯片制备

蛋白芯片上的蛋白根据研究目的的不同,可以选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的蛋白质,利用原位制备或制备后交联等方法,将不同的探针蛋白质,按设计好的序列固化于固相载体。蛋白芯片制备的关键是制备时注意维持蛋白质的天然构象(防止蛋白变性,维持原有特定的生物学活性)。

样品预处理

蛋白质芯片的探针蛋白特异性高、亲和力强,受其它杂质的影响低,因此对生物样品的要求较低,只需对少量样本进行沉降分离和标记后,即可加于芯片上进行分析和检测。甚至可以直接利用生物材料(血样、尿液、细胞及组织等)进行分析。

共孵育与检测

目前主流蛋白质芯片的信号检测方式主要是荧光检测形体系。将蛋白质芯片与荧光素标记的生物靶分子(核酸或蛋白质等)进行杂交,洗脱未结合组分后通过共聚焦荧光扫描仪或CCD荧光成像仪在特定的波长下激发荧光,获得反应结合的信号。

数据分析

对荧光标记的芯片用共聚焦荧光显微镜进行扫描,然后通过计算机分析出每个点的平均荧光密度。
在每个芯片的制作过程中应设计有阴阳性对照反应,或已在多次实验中找到一个判断阴阳性结果的界值,作为判断结果的根据。将每个点的荧光密度或灰度除去背景干扰后与相对界值进行比较,根据信号的有无、多少进行定性或定量分析。当然,在结果分析过程中需要对大量数据进行复杂处理,这些都需要通过特定的计算机软件来完成。

蛋白质芯片优点

  • 微量化:所需样品量极少
  • 高通量:可以实现成千上万个蛋白质的平行分析
  • 蛋白芯片使用相对简单,结果正确率较高
  • 样品要求低,可直接对不经处理的各种体液和分泌物进行检测

存在问题

  • 成本过高,需一系列昂贵的尖端仪器
  • 芯片的标准化问题

蛋白质芯片技术应用

利用蛋白质芯片技术可以检测蛋白-蛋白、蛋白-小分子、蛋白-DNA、蛋白-抗体、蛋白-脂类之间的相互作用。
蛋白质芯片技术应用

图2:蛋白质芯片技术应用

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