重组抗体表达实验案例

概述:本文为重组抗体表达案例介绍,介绍了完整的重组抗体表达实验流程,包括实验设计、质粒抽提、CHO细胞复苏、CHO细胞转染、重组抗体纯化及稳定性检测等实验步骤及各个步骤的详细操作流程。

第一部分 实验设计

该案例为德泰生物重组抗体表达服务的一个项目,采用德泰生物最新开发的密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program (V13)对提供的重组抗体H(以下简称rAb-H)蛋白氨基酸序列进行优化,采用全基因合成并通过双酶切法将将rAb-H基因插入到表达载体proEM中,并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性,最终转到DH5a克隆菌株中,通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒,之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞CHO中进行瞬时表达,在通过Protein A亲和层析纯化rAb-H蛋白。

第二部分 重组抗体rAb-H在哺乳动物系统中表达与纯化

一、转染级质粒扩增抽提

  1. rAb-H质粒转化DH5a
    • 分别吸取rAb-H的Light Chain和Heavy Chain表达质粒80-100ng加入已制备的DH5a感受态细胞中;
    • 将加入质粒后的感受态细胞通过热激42℃,90s转化;
    • 将转化后的感受态细胞加入 LB液体培养基,放入摇床37℃,200rpm震荡培养约30nim;
    • 将培养后的感受态细胞取出,吸取部分悬液涂在含有氨苄抗性的平板上,放入培养箱,37℃,过夜培养;
    • 从新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mL LB培养基,37℃,200rpm培养8h;
    • 按1/500比例接种于200mL LB培养基中,37℃,200rpm培养16h;
    • 收集培养后的菌液离心,去掉上清.
  2. rAb-H质粒抽提(Qiagen转染级质粒抽提试剂盒)
    • 1%琼脂糖凝胶分析抽提的rAb-H质粒,结果如下:
      case-s
    • 转染级质粒DNA质粒质量测定
检测内容 转染级质粒标准 Light Chain质粒检测结果 Heavy Chain质粒检测结果
A260/A280 1.8-2.0 1.86 1.85
内毒素 内毒素<50EU/mg 鲎试剂检测,<50EU/mg 鲎试剂检测,<50EU/mg
无菌检测 无菌 LB平板检测,无菌落 LB平板检测,无菌落

二、CHO细胞复苏与传代

  • 提前将水浴锅打开37℃;培养基提前在37℃预热;
  • 从液氮罐中取出冻存的CHO细胞;
  • 把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动使其快速融化(约1min),取出;
  • 用75%乙醇消毒管外壁,放入生物安全柜内,转移到含10mL培养基的 15mL离心管中,离心800 rpm,5 min;
  • 离心后的细胞去掉上清,取少许新鲜培养基重悬细胞,再转移到培养瓶中,加入新鲜培养基轻轻摇动,使细胞分散均匀,取细胞计数及活力检测,使密度控制在3-4×105 cells/mL,活力>95%;
  • 置于培养箱中110rpm,37℃,5% CO2培养;
  • 细胞培养2-3天,密度达到2.0×106 cells/mL 左右时需对细胞进行传代;
  • 从培养瓶中取出部分培养物弃掉,再向培养瓶中补加新鲜培养基,对剩余的细胞培养物稀释(留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定);
  • 放入培养箱中110rpm,37℃,5%CO2,继续培养;
  • 每天需对细胞密度及活力检测,当细胞密度达到2×106 cells/mL左右时,要对细胞进行传代;

三、rAb-H质粒转染CHO细胞

  • 转染前2天将CHO细胞悬浮培养至1.5 L,接种密度为4 – 5×105 cells/mL,置于培养箱中110rpm,37℃,5% CO2培养;
  • 转染当天使细胞密度控制在1.5-2×106 cells/mL;
  • 将转染缓冲液、转染试剂等试剂提前放入培养箱或水浴锅37℃预热(10-20min);(转染方法介绍
  • DNA-转染试剂混合物:向转染缓冲液中加入Light Chain和Heavy Chain表达质粒和转染试剂混匀,37℃温育10min;
  • 将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中,放入培养箱中110rpm,37℃,5%CO2培养;
  • 收集:转染后约5-6天,取出细胞培养物,离心,收集上清或细胞;

四、rAb-H 纯化

  • 取转染培养6天后的细胞培养液离心,上清用0.22um膜过滤,在4℃环境下透析至缓冲液20 mM Na2HPO4,150 mM NaCl,pH 7.0中,透析结束后再用Protein A柱纯化,结果如下:fig2
    经Protein A亲和层析纯化,目标蛋白rAb-H主要存在于洗脱组分Lane 4-6中,收集上述目标蛋白,并将其透析到1XPBS, 10% Glycerol, pH7.4中,透析结束后用0.22um膜过滤,并分装冻于-80℃

第三部分 重组抗体rAb-H蛋白质检

  1. rAb-H稳定性测试(冻融实验)
  2. 取一支分装后冻于-80℃的rAb-H蛋白,放置于冰水混合物中待其缓慢融化,融化后无异常现象,说明rAb-H蛋白冻融实验是正常的。

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