杂交瘤细胞克隆化的常用方法

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。下载因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的方法很多,有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法:

有限稀释法

材料

96孔细胞培养板、HT培养基、活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞

方法

  1. 制备小鼠腹腔巨噬细胞(饲养细胞);
  2. 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15、50个细胞3种不同的稀释度;
  3. 按照每毫升加入5×104-1×105细胞的比例,在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞;
  4. 进行杂交瘤细胞96孔板分装,每个稀释度32孔,每孔量为0.2ml,每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10;
  5. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天,出现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的阳性孔,再次进行克隆
  6. 重复上述步骤3~5次,直至阳性孔率100%
  7. 进行抗体检测、细胞胞扩大培养并冻存。

说明:本法中(b)(c)(d)等步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确的进行系列稀释,直至每毫升含10个细胞,按每孔接种0.1ml细胞悬液,即每孔含1个细胞。

软琼脂法

材料

HT培养基(双倍浓度)、小鼠腹腔细胞、灭菌平皿、活力很好的杂交瘤细胞、45℃水浴、2%琼脂糖生理盐水(用0.15mol/L NACl配置的2.0%琼脂糖,称取2.0g细胞培养用琼脂糖,悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl,121℃高压灭菌15分钟,分装10ml小瓶,冷却后4℃保存)

方法

  1. 在培养皿中制备单层饲养细胞(小鼠腹腔细胞);
  2. 临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀,配成1%琼脂糖培养液,45%水浴中温育;
  3. 制备杂交瘤细胞悬液:吸取平皿上层培养液,加入1%琼脂糖培养液3ml,室温10 min;
  4. 取杂交瘤细胞悬液1ml,加入1%琼脂糖培养液1ml混匀,铺于培养皿上层;
  5. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-14天,克隆生长至2mm时,用毛细吸管吸出克隆,直接转种于含有饲养细胞的24孔板,扩大培养;
  6. 吸取上清,检测抗体,阳性孔可继续克隆化,或扩大培养、冻存。

注意事项

  • 杂交瘤细胞的克隆化需尽早进行,避免其他细胞影响了抗体分泌细胞的生长。
  • 注意无菌操作,一旦发现污染必须及时处理。
  • 做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清。
  • 每次克隆化得到的阳性亚克隆,在继续进行克隆化或扩大培养的同时,应及时冻存几支。

更多阅读

杂交瘤单抗制备实验流程
单克隆抗体分类及单抗发展历程

相关服务

单克隆抗体制备服务

仅供科研

联系我们

电话:(025)5889-4959

咨询:Sales@DetaiBio.com

地址:南京市高新开发区星火路10号

苏ICP备14041760号