蛋白质在制备过程中,由于蛋白分离纯化过程而使得样品变得很稀,澄清后的蛋白质溶液常常需要进行浓缩,以提高蛋白质浓度,减少样品体积,这样有利于随后进一步进行蛋白质色谱纯化。
常用的浓缩方法有吸附法、超滤法、沉淀法、透析干燥法等。每种方法都有自己的优缺点,比如吸附法选择性比较差,不能连续操作,浓缩倍数低;超滤法成本低,操作方便,条件温和,能较好的保持生物大分子活性,回收率高等;沉淀作用对样品中的蛋白质浓度要在100mg/L以上,并且由于相变导致收率较低;透析法浓缩需要比较长的时间,体积也受到一定限制;冷冻干燥所需时间长,收率低且在浓缩蛋白的同时也浓缩了盐。
吸附法是指通过吸附剂直接吸收除去溶液中水分子使之浓缩。所用的吸附剂必须与溶液不起化学反应,对蛋白不吸附,易于溶液分开。吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法,所需仪器简单,适用于稳定性较差的蛋白质。常用的吸附法主要有透析袋浓缩和凝胶浓缩。
超滤法是使用一种特殊的薄膜,能够对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤。液体在一定压力作用下通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留。该方法最适于生物大分子尤其是蛋白质的浓缩或脱盐。应用超滤法的关键在于膜的选择,水的流速,分子量和截止值等。
沉淀法是早期的蛋白纯化分离方法,但现在只用于蛋白质的初步分离,然后采用色谱法进一步纯化。蛋白质分子在水溶液中离子集团相互作用,通过改变PH值或离子强度,加入有机溶剂或多聚物,可以促进蛋白质分子凝聚,形成蛋白质沉淀,再通过离心或过滤可以获得沉淀物,然后利用合适的缓冲液清洗,溶解沉淀物,再经过透析或凝胶过滤,除去残留的溶剂成分。
材料:
50%乙醇
10mmol/L EDTA,PH 8.0
0.05mmol/L NaHCO3
1g/L 叠氮钠
蛋白质溶液
透析袋
透析袋夹
方法:
如何处理新的透析袋
将减下的新的透析袋浸入蒸馏水中,用手指捏住透析袋将俩层分开,先用50%乙醇彻底冲洗透析袋里外侧(如果是蛋白方面的工作,建议不要煮透析袋,为了更彻底地除去甘油和硫,可以将透析袋浸入到50%的乙醇中),然后在一个1L的烧杯中混合400mL 10mmol/L EDTA(PH 8.0)和400mL 0.05mmol/L NaHCO3,将透析袋移入烧杯中,用磁力搅拌器搅拌30min;用800mL水替换溶液,搅拌10min,重复一次,将透析袋移入新蒸馏水中。透析袋用完之后,4℃保存于含0.1%叠氮化钠的水中,任何时候都不要让透析袋变干。
浓缩样品
浓缩管使用后的处理和保存
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