蛋白质浓缩技术介绍及操作简介

简介

蛋白质在制备过程中,由于蛋白分离纯化过程而使得样品变得很稀,澄清后的蛋白质溶液常常需要进行浓缩,以提高蛋白质浓度,减少样品体积,这样有利于随后进一步进行蛋白质色谱纯化。

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浓缩技术分类

常用的浓缩方法有吸附法、超滤法、沉淀法、透析干燥法等。每种方法都有自己的优缺点,比如吸附法选择性比较差,不能连续操作,浓缩倍数低;超滤法成本低,操作方便,条件温和,能较好的保持生物大分子活性,回收率高等;沉淀作用对样品中的蛋白质浓度要在100mg/L以上,并且由于相变导致收率较低;透析法浓缩需要比较长的时间,体积也受到一定限制;冷冻干燥所需时间长,收率低且在浓缩蛋白的同时也浓缩了盐。

吸附法

吸附法是指通过吸附剂直接吸收除去溶液中水分子使之浓缩。所用的吸附剂必须与溶液不起化学反应,对蛋白不吸附,易于溶液分开。吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法,所需仪器简单,适用于稳定性较差的蛋白质。常用的吸附法主要有透析袋浓缩和凝胶浓缩。

超滤法

超滤法是使用一种特殊的薄膜,能够对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤。液体在一定压力作用下通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留。该方法最适于生物大分子尤其是蛋白质的浓缩或脱盐。应用超滤法的关键在于膜的选择,水的流速,分子量和截止值等。

沉淀法

沉淀法是早期的蛋白纯化分离方法,但现在只用于蛋白质的初步分离,然后采用色谱法进一步纯化。蛋白质分子在水溶液中离子集团相互作用,通过改变PH值或离子强度,加入有机溶剂或多聚物,可以促进蛋白质分子凝聚,形成蛋白质沉淀,再通过离心或过滤可以获得沉淀物,然后利用合适的缓冲液清洗,溶解沉淀物,再经过透析或凝胶过滤,除去残留的溶剂成分。

浓缩操作实验方法

透析袋浓缩

材料:

50%乙醇
10mmol/L EDTA,PH 8.0
0.05mmol/L NaHCO3
1g/L 叠氮钠
蛋白质溶液
透析袋
透析袋夹

方法:

  1. 选择合适MWCO的透析袋,剪下需要长度的干透析袋,只能用无粉手套触摸透析袋;
  2. 用透析夹关闭透析袋的一端,把蛋白样品加入透析袋中,再关闭另一端,在透析袋里留下一定的空间,并检查每一端样品有无渗漏;
  3. 将装好样品的透析袋放入装有透析袋放入装有透析缓冲液的烧杯中,确信透析袋被完全浸没,然后把烧杯放在磁力搅拌器上搅拌,整个装置放在有适当温度(通常为4℃,以增加蛋白质稳定性)的环境中;
  4. 可以通过测定透析缓冲液缓冲液的电导来检测,当透析液的电导增加慢下来时,就更换缓冲液,直到在经过1~2h的搅拌后电导基本保持不变为止,如果没有电导仪,至少再换一次缓冲液,间隔时间为4~6h,若样品体积较大或透析袋大于20mm,间隔时间可为8~12h;
  5. 从缓冲液中取出透析袋,用蒸馏水冲洗,除去夹子后将透析过的样品小心倒入容器内;
  6. 通过比较透析样品和未用过的透析缓冲液的电导值,证实达到所希望的盐浓度。

如何处理新的透析袋

将减下的新的透析袋浸入蒸馏水中,用手指捏住透析袋将俩层分开,先用50%乙醇彻底冲洗透析袋里外侧(如果是蛋白方面的工作,建议不要煮透析袋,为了更彻底地除去甘油和硫,可以将透析袋浸入到50%的乙醇中),然后在一个1L的烧杯中混合400mL 10mmol/L EDTA(PH 8.0)和400mL 0.05mmol/L NaHCO3,将透析袋移入烧杯中,用磁力搅拌器搅拌30min;用800mL水替换溶液,搅拌10min,重复一次,将透析袋移入新蒸馏水中。透析袋用完之后,4℃保存于含0.1%叠氮化钠的水中,任何时候都不要让透析袋变干。

超滤浓缩

浓缩样品

  1. 要浓缩的样品含盐量必须0.3M以上,含盐量低的样品须补加到0.3MNaCl;
  2. 在内管(附有3KD膜)中加入500μl样品,将内管套入外管;
  3. 对称放置离心管,14520rpm(即14000g)离心。(离心5min约浓缩2倍,10min约4倍,15min约6倍,20min约8倍,30min约10倍);
  4. 离心结束后,将内管倒置套在另一个干净的离心管呢,3880rpm离心min收集浓缩后的样品。或者用移液器直接吸出内管中的样品。

浓缩管使用后的处理和保存

  1. 使用完的浓缩管,立即加入500μl含1MNaCl的缓冲液(此缓冲液与浓缩样品的缓冲液一致),8000rpm离心20min;
  2. 甩净内管中的盐溶液,将内管放入超纯水中浸泡1h;
  3. 内管加入超纯水500μl,8000rpm离心5min;
  4. 甩净内管中的水,加入500μl0.2MNaOH,8000rpm离心20min;
  5. 甩净内管中的NaOH溶液,用超纯水再8000rpm离心5min;
  6. 甩净内管中的水,放入含0.2-0.5‰NaN3的生理盐水中;
  7. 外管用自来水洗净后,用超纯水冲洗干净,晾干。

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