测序样品分析与问题解决

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摘要:本文主要对测序中经常遇到的问题进行总结并提出解决方法,同时对测序样品的要求作出分析,帮助我们在测序前对样品做好准备,并在失败的结果中找到解决方法。

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测序样品分析

  1. 测序的样品可以有PCR产物,菌(新鲜菌液、穿刺菌、平板菌、甘油菌),质粒。测序提供的样品最基本的原则就是要保证样品的量和纯度。
  2. PCR产物测序,PCR产物测序的第一要素是PCR产物的纯度,如果是PCR产物原液,则需要经过琼脂糖凝胶电泳纯化后再进行测序,如果不经过电泳产物回收纯化这一步,测序容易出现乱峰或叠峰,如果是已经纯化好的PCR产物,可直接测序。第二要素是引物,引物必须经过纯化,纯度至少大于90%。
  3. 菌液测序,需提供足量的新鲜的菌液,新鲜菌液成功率较高,测序公司可以直接提取质粒测序。
  4. 菌体可以是多种形式平板菌、穿刺菌。两者都是在含有抗生素的固体培养基中,可用肉眼观察到菌落并保证无杂菌污染。
  5. 质粒测序要提供一定浓度和量,注明名称,酶切位点及片段大小。此外,小于100bp片段一般是先克隆再测序,直接测序较难得到结果。

测序问题与解决

  1. 测序信号衰减/中断
  2. 测序信号衰减/中断

    测序信号衰减或中断是测序过程中的常见问题,原因多种多样:模板中含有重复序列,或是模板含有高级结构所致,模板中GC含量过高等都有可能使测序信号衰减,此外,引物的质量,试剂失活也有可能造成此现象。解决方法:采用反向引物测序,通过序列拼接获得全长,过程中可适当的加入DMSO,并使用高级试剂盒扩增。

  3. 测序出现重叠峰/乱峰
  4. 测序出现重叠峰/乱峰

    测序中间出现重叠峰(双峰),是因为序列前面有连续的碱基出现,或是测序引物碱基缺失。如果一直出现重叠峰,就是序列本身有非特异性条带,非特异性条带的话就要从PCR扩增开始分析,注意提高PCR扩增的特异性,扩增可以选择高特异性的Taq酶(如热启动酶),能够大大的降低错配,提高扩增序列的特异性。也可以做TA克隆,采用单克隆测序。测序的引物,最好自己提供,保证引物的特异性并防止降解(不要选择通用引物),同时表明测序结果提供序列全长。

  5. poly结构测序结果乱峰/衰减/中断
  6. Poly(A/T/C/G)结构的测序易出现移码现象并导致测序信号衰减中断,这是因为序列中有连续的碱基出现所致,建议采用反向引物测序获得全长。

  7. 测序结果为空载体
  8. 目的片段插入失败(提供的克隆为阳性克隆)或培养过程中目的片段丢失,只要重新挑取单克隆,进行PCR后送去测序即可。

  9. 测序引物
  10. 测序引物要求较高,理论上可以用PCR扩增时的引物测序,但不能测得全长,当测序完成时,可以从中间设计引物反向测一个,这样便能得到序列全长。测序的引物3’端要和模板完全配对,长度16-22bp左右,GC含量50%左右,测序引物纯度有很高要求,必须经过纯化且纯度至少大于90%。

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